Deletion of Non-Repeat Domain 1 Region in Vibrio vulnificus MARTX Toxin Eliminates its Ability to Induce Host Cell Blebbing

Abstract

The MARTX (multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin) toxin is the primary virulence factor of Vibrio vulnificus, a pathogen causing sepsis via seafood contamination or open wound infection. After secretion, V. vulnificus MARTX toxin (MARTXVv toxin) forms a pore in host cell membrane using its repeats-containing regions at the amino- and carboxyl- termini. The pore translocates toxin effector domains into the host cell, causing cytotoxicity/cytopathicity and cell blebbing, ultimately leading to necrotic cell death. However, the specific region responsible for cell blebbing remains unclear. Given that the blebbing can occur independently of effector domains, the non-repeat domains (NRDs) within the repeats-containing regions were focused on. The NRDs were precisely assigned through ColabFold-aided structural predictions. To examine the role of NRDs, V. vulnificus genome were engineered to construct a series of reporter strains. In these strains, the MARTXVv toxin contains an actin cross-linking domain (ACD) and β-lactamase (Bla) instead of the authentic effector domains, with each NRD further deleted. The Bla activity in the reporter bacterial cell cultures confirmed that the deletion of any NRDs does not have an adverse effect on toxin secretion. However, host cells treated with the NRD1 deleted strain did not exhibit the toxin-mediated cell blebbing and activation of MAPK signaling pathways. Nevertheless, the NRD1 deleted strain preserved effector translocation ability, as the reporter ACD activity was noticeable in the treated cell cytosol, albeit with delayed activity. In conclusion, our study identifies NRD1 plays an important role in MARTXVv toxin-host cell interactions related to the effector translocation and is a critical region contributing to necrotic cell death. These findings provide insights into the mechanism of action of the MARTXVv toxin and may guide the development of targeted therapeutic strategies to reduce the severity of V. vulnificus infection.;MARTX(multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin) 독소는 해산물 섭취나 상처 감염을 통해 패혈증을 일으키는 병원균인 비브리오 패혈증균의 주요 독성 인자이다. 비브리오 패혈증균의 MARTX 독소 (MARTXVv)는 세균으로부터 분비된 이후 반복 서열이 포함된 아미노·카르복실 말단 부분을 이용하여 숙주 세포막에 기공을 형성한다. 해당 기공을 통해 독소의 effector 도메인을 숙주 세포 내부로 전달하여 세포 독성 및 수포(cell blebbing) 형성을 유도함으로써 궁극적으로 세포 괴사를 유발한다. 그러나 MARTXVv 독소 내에서 세포의 수포를 형성시키는 특정 영역은 아직 규명되지 않았다. 세포의 수포 형성은 MARTXVv 독소의 effector 영역과 독립적으로 발생한다는 점을 고려하여 반복 서열이 포함된 아미노·카르복실 말단 부분 내의 비반복 도메인(non-repeat domain, NRDs)에 초점을 두었고 ColabFold을 이용한 구조 예측을 통해 NRDs 부분을 지정했다. 이후, NRDs의 역할을 규명하기 위해 비브리오 패혈증균의 유전체를 엔지니어링 하여 리포터 균주를 제작했다. 해당 균주에서 MARTXVv 독소는 실제 effector 도메인들 대신 actin across-linking domain (ACD) and β-lactamase (Bla)을 삽입했으며 추가적으로 NRDs을 삭제했다. 리포터 균주들을 배양하여 세균 밖으로 분비된 배양액에서 Bla의 활성을 확인함으로써 NRDs의 결여에도 독소가 유의적으로 분비됨을 확인했다. 그러나, NRD1이 결실된 균주에 감염된 숙주 세포는 MARTXVv 독소가 매개하는 세포의 수포 형성과 MAPK 신호 경로가 활성화되지 않았다. 이때, NRD1 결여 균주는 세포 내부로의 effector 전달 능력은 유지되었는데, 이는 감염된 세포의 세포질에서 속도가 지연되기는 했지만 ACD 활성이 관찰되었기 때문이다. 결론적으로, 본 연구는 NRD1이 MARTXVv 독소-숙주 세포 상호 작용에서 중요한 역할을 하며 괴사성 세포 사멸에 기여하는 중요한 영역임을 밝혔다. 해당 연구 결과는 MARTXVv 독소의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며 비브리오 패혈증균 감염의 심각성을 완화시키기 위한 표적 치료제 개발의 가능성을 제공해준다.