Advanced therapeutic application of tissue-resident stem cells for intractable diseases

Abstract

PART I. Stem cell-based therapeutic approach inducing revascularization and regeneration of ischemic tissue may provide an underlying solution of critical limb ischemia (CLI). Cardiac stem cells (CSCs) might be optimal cell source for CLI treatment owing to their superb endothelial differentiation potential and angiogenic paracrine functions. Angiogenic ability of CSCs could be maximized by genetic engineering with constitutively active form of hypoxia-inducible factor-1α (CA-HIF-1α), resistant to oxygen-dependent degradation. CSCs transfected with CA-HIF-1α (CA-HIF-CSCs) promoted supplementary expression of proangiogenic factors including VEGF, bFGF, Ang-1 and PDGF-B, along with enhanced angiogenic function including migratory effect, tube formation ability and endothelial differentiation potential. In the mouse CLI model, CA-HIF-CSCs were transplanted into the ischemic region using fibrin gel as a cell delivery vehicle. CA-HIF-CSC/gel treatment resulted in increased blood perfusion (up to 77%) and limb functional recovery with minimal incidence of foot necrosis and limb loss. Immunofluorescence analysis of vessel density in CA-HIF-CSC/gel group revealed 1.43-fold and 1.34-fold increase in CD31 and α-SMA positive area, respectively, compared to CSC/gel group. Histological evidences further confirmed that CA-HIF-CSC/gel treatment markedly alleviated muscle degeneration and fibrosis compared to any other treatment groups. CSCs genetically engineered with constitutively active HIF-1α might provide a novel therapeutic modality in CLI converging stem cell and gene therapy. PART II. As an advanced stem cell-based therapeutics for Parkinson’s disease (PD), the exosomes from neural crest stem cells (NCSCs) are promising owing to the potent cell source with superior proliferative ability with minimal cell senescence and neuronal specific paracrine function compared to other tissue origin mesenchymal stem cells. The NCSC-exosomes were characterized by their spherical morphologies with 30 – 100 nm of size and positive expression of exosome markers (CD63, CD9, and CD81). NCSC-exosome treatment enhanced SH-SY5Y cell proliferation in a dose-dependent manner, suggesting that the NCSC-exosomes might be beneficial to replenish the degenerated lesion in the PD brain by promoting proliferation of endogenous dopaminergic cells. To evaluate neuroprotective ability of NCSC-exosomes, PD in vitro model was established using MPP+, dopaminergic cell specific neurotoxin. NCSC-exosome treatment resulted in attenuated MPP+-induced cytotoxicity, and the exosome dose was determined as 15 µg/mL which demonstrated reversed cell viability to 95.8% of control. It was noted that NCSC-exosome treatment revealed protective effect against apoptotic features such as structural changes in cells and their nuclei, integrity of cell membrane, and PARP cleavage. MPP+-induced oxidative stress was also decreased by 13% of the intracellular reactive oxygen species accumulation in the NCSC-exosome treated group compared to MPP+ only treated group. Collectively, NCSC-exosomes could potentially be developed as a novel treatment strategy in dopaminergic degeneration of PD.;줄기세포는 자가증식과 특정 세포로 분화가 가능하여 일반적인 치료로는 완치가 어려운 허혈성 질환, 신경퇴행성질환, 그리고 면역학적 질환 등에서 줄기세포를 이용한 재생치료제 개발 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 다수의 임상시험에서 줄기세포의 안전성 및 약간의 치료효과가 보고되었지만 객관적인 치료 효과를 입증하지 못하였다. 이러한 미미한 치료효과는 체내로 투여된 세포가 전달되어 손상된 조직 환경에 적응, 생착이 어렵고, 제한된 조직특이 분화능에 기인한다. 따라서 기존 줄기세포의 한계점을 개선하고 치료 효율을 제고시킬 수 있는 고도화된 전략이 필요하다. 첫째로 치료목적에 부합하는 최적의 줄기세포원을 사용하는 것이다. 줄기세포의 기능은 줄기세포 조직원과 밀접한 연관이 있는데, 성숙한 조직과 기관 속에 내재되어 있는 조직특이 줄기세포(tissue-resident stem cells)는 기존 골수 및 지방유래 중간엽줄기세포에 비해 탁월한 조직특이적인 분화 및 주변분비 효과를 나타내어 표적 질환에 특이적 치료효과를 기대할 수 있다. 둘째, 유전자 조작, 약물 전처치 등을 통해 줄기세포의 기능을 강화시키는 전략이다. 특히 줄기세포에 원하는 치료유전자를 도입한 첨단바이오융복합제제는 줄기세포의 효과적인 기능 개선이 가능할 수 있다. 마지막으로, 줄기세포가 주변분비작용을 통해 생체 내재된 조직복구과정을 활성화시키는데에 주요한 역할을 하는 엑소좀을 활용하는 방법이다. 줄기세포 엑소좀은 줄기세포의 치료작용을 재현하는 동시에 살아있는 세포 주입에 대한 안전성 문제를 최소화하고 나노 수준의 크기에 따른 다양한 투여 경로의 적용 가능성 등의 장점이 있어 줄기세포 기반 치료제의 새로운 대안으로 유망하다. 심장유래 줄기세포는 다른 조직원에서 유래한 줄기세포에 비해 우수한 내피세포 분화능 및 혈관신생능을 나타내기 때문에 중증하지허혈 질환 치료에 유망한 줄기세포원이다. 저산소유도인자(HIF-1α) 유전자를 세포 내에 도입하여 심장유래 줄기세포의 혈관신생능을 극대화시켰다. 저산소유도인자가 도입된 심장유래 줄기세포는 혈관신생 촉진인자의 발현이 증가됨에 따라, 세포 이동능, 혈관망형성능, 그리고 혈관내피세포 분화능이 강화되었다. 중증하지허혈 동물모델에서 저산소유도인자 도입 심장유래 줄기세포의 전달율을 개선하기 위해 피브린 젤을 사용하여 허혈성 근육에 이식되었다. 피브린 젤과 함께 전달된 저산소유도인자 도입 심장유래 줄기세포는 허혈성 다리근육 내에서 혈액 관류를 증가시키고 사지 기능 회복을 유도했다. 이와 더불어 조직학적 염색 결과는 다른 치료군에 비해 가장 높은 혈관 밀도를 나타냈으며 근육 퇴화 및 섬유화가 현저하게 완화됨을 확인했다. 저산소유도인자 유전자로 조작된 심장유래 줄기세포는 줄기세포 및 유전자 치료제의 첨단바이오융복합제제로써 난치성 중증하지허혈질환에 새로운 치료 양식을 제공할 수 있을 것이다. 신경능선유래 줄기세포는 다른 중간엽줄기세포에 비해 우수한 체외증식능, 신경특이적 분비능으로 신경퇴행성질환 치료용 엑소좀의 세포원으로 적합하다. 신경능선유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 초원심분리법으로 분리하여 파킨슨병 세포모델에서 신경재생능 및 신경보호능을 평가하였다. 신경능선유래 줄기세포 엑소좀은 구형 형태의 30-100 nm 직경을 가지며, 엑소좀 특이 표지자인 CD63, CD9, 및 CD81을 발현했다. 신경능선유래 줄기세포 엑소좀을 신경아세포종 세포에 처리 시 농도의존적인 증식촉진효과가 나타났다. 또한 도파민 세포를 특이적으로 사멸시키는 신경독(MPP+)을 이용한 파킨슨병 세포모델에서 신경능선유래 줄기세포 엑소좀의 신경보호능을 평가했다. 신경능선유래 줄기세포 엑소좀은 MPP+에 의해 유도된 세포 자살, 세포내 활성산소종 축적을 완화시켰다. 신경능선유래 줄기세포 엑소좀은 파킨슨병에 의한 도파민 신경세포의 퇴행을 치료하기 위한 신규 치료전략으로 개발될 수 있는 가능성을 보여주었다.