Proteome-wide mapping of isoform-specific disulfide bond networks under oxidative stress

Abstract

Oxidative stress regulates diverse cellular processes through reversible modification of reactive cysteine residues in proteins. Among these modifications, disulfide bond formation plays a central role in redox-dependent regulation of protein structure, activity, and intermolecular interactions. However, conventional proteomic workflows typically employ reducing agents during sample preparation, resulting in disruption of native disulfide linkages and loss of structurally informative redox-sensitive proteoforms. Consequently, the global organization of disulfide-mediated protein networks under oxidative stress remains incompletely understood. To address this limitation, we combined liquid chromatography–mass spectrometry （LC–MS）-based metabolomics with non-reducing tandem mass tag （TMT）-based quantitative proteomics to investigate oxidative stress-induced proteome remodeling in MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells. Cells were exposed to increasing concentrations of hydrogen peroxide （H₂O₂）, followed by metabolomic profiling and large-scale proteomic analysis under non-reducing conditions. Native disulfide-linked proteoforms were preserved by non-reducing SDS-PAGE, and intra- and inter-protein disulfide bonds were identified using the DBond algorithm. Metabolomic analyses revealed concentration-dependent disruption of multiple metabolic pathways, including glycolysis, the tricarboxylic acid cycle, nucleotide metabolism, and amino acid metabolism. Accumulation of upstream glycolytic intermediates together with depletion of downstream metabolites suggested redirection of metabolic flux toward the oxidative pentose phosphate pathway. These alterations were accompanied by marked changes in cellular redox homeostasis and energy metabolism. Proteomic analyses identified extensive oxidative stress-responsive proteoform remodeling and revealed more than one thousand proteins participating in intra- or inter-protein disulfide bonding networks. Numerous proteins displayed redox-dependent mobility shifts and secondary electrophoretic bands corresponding to distinct proteoforms. Disulfide-linked proteins were enriched in functional categories associated with metabolism, protein folding, cytoskeletal organization, and signal transduction. Network analyses further identified previously uncharacterized disulfide-associated protein clusters, suggesting the existence of higher-order redox-regulated interaction networks. Notably, homologous protein isoforms frequently exhibited distinct disulfide-linking patterns despite high sequence similarity, demonstrating that disulfide bond formation is strongly influenced by local structural and redox environments rather than primary sequence alone. Sequence analysis revealed that disulfide-forming cysteine residues were preferentially associated with nearby positively charged amino acids, particularly lysine and arginine residues, whereas neighboring cysteine residues were relatively depleted. These findings suggest that local electrostatic environments contribute to selective thiolate formation and disulfide bond generation. Collectively, this study provides a proteome-wide map of redox-sensitive disulfide bond networks and demonstrates that oxidative stress induces highly selective and isoform-specific proteoform remodeling. Our findings establish a framework for investigating cysteine-based regulatory mechanisms and highlight the utility of non-reducing proteomics for uncovering dynamic redox-dependent protein interaction networks in both physiological and pathological contexts.;활성산소종에 의한 산화적 스트레스는 단백질 내 반응성 시스테인 잔기의 가역적 변형을 통해 다양한 세포 기능을 조절한다. 이들 변형 중 이황화결합（disulfide bond）은 단백질의 구조, 활성 및 단백질 간 상호작용을 조절하는 중요한 산화환원 조절 기전으로 알려져 있다. 그러나 기존의 단백질체 분석법은 시료 준비 과정에서 환원제를 사용하는 경우가 많아 본래 존재하던 이황화결합이 제거되므로, 산화적 스트레스에 의해 형성되는 이황화결합 네트워크와 proteoform 변화를 분석하는 데 한계가 있다. 본 연구에서는 산화적 스트레스에 의한 단백질 및 대사체 변화를 규명하기 위하여 MDA-MB-231 삼중음성유방암 세포에 과산화수소를 처리한 후, LC–MS 기반 metabolomics와 non-reducing TMT 기반 quantitative proteomics를 수행하였다. 비환원 조건에서 SDS-PAGE를 수행하여 native disulfide bond를 보존하였으며, DBond 알고리즘을 이용하여 단백질 내 및 단백질 간 이황화결합을 분석하였다. 대사체 분석 결과, 해당과정（glycolysis）, TCA cycle, nucleotide metabolism 및 amino acid metabolism을 포함한 다양한 대사경로에서 농도 의존적인 변화가 관찰되었다. 특히 상류 해당과정 대사체의 축적과 하류 대사체의 감소는 NADPH 생성을 위한 oxidative pentose phosphate pathway로의 대사 흐름 전환을 시사하였다. 또한 고농도의 과산화수소 처리군에서 GSSG의 현저한 증가와 ATP, GTP 및 NAD⁺/NADH ratio의 감소가 관찰되어 산화적 스트레스에 따른 세포 내 산화환원 항상성 및 에너지 대사의 변화를 확인하였다. 단백질체 분석에서는 산화적 스트레스에 반응하는 다양한 proteoform 변화가 관찰되었으며, 1,000개 이상의 단백질에서 단백질 내 또는 단백질 간 이황화결합이 확인되었다. 다수의 단백질은 non-reducing SDS-PAGE 상에서 이동도 변화 및 secondary band를 나타냈으며, 질량분석을 통해 이들이 서로 다른 redox-dependent proteoform임을 확인하였다. 이황화결합 단백질은 대사, 단백질 접힘, 세포골격 조절 및 신호전달과 관련된 기능군에 풍부하게 분포하였다. 또한 네트워크 분석을 통해 기존에 알려지지 않은 이황화결합 기반 단백질 클러스터가 확인되었으며, 이는 산화환원 조절에 의해 형성되는 고차원적 단백질 상호작용 네트워크의 존재 가능성을 시사하였다. 동일 단백질군 내에서도 isoform 간에 서로 다른 이황화결합 패턴이 관찰되었으며, 이는 이황화결합 형성이 단순한 아미노산 서열 유사성보다는 국소 구조 및 산화환원 환경에 의해 결정됨을 시사한다. 또한 이황화결합을 형성하는 시스테인 주변에서는 lysine과 arginine과 같은 양전하 아미노산이 상대적으로 풍부하였으며, 인접한 시스테인 잔기는 감소하는 경향을 나타냈다. 이러한 결과는 국소 전기적 환경이 thiolate 형성과 이황화결합 형성을 촉진하는 데 기여할 수 있음을 보여준다. 종합하면, 본 연구는 산화적 스트레스에 의해 형성되는 이황화결합 네트워크를 단백질체 수준에서 체계적으로 분석하고, 산화적 스트레스가 선택적이며 isoform-specific한 proteoform remodeling을 유도함을 보여준다. 또한 non-reducing proteomics의 유용성을 제시하고, 생리적 및 병리적 조건에서 시스테인 기반 산화환원 조절 기전을 이해하기 위한 기초 자료를 제공한다.