Discovery and Engineering of a Novel Thermostable Secretory Phospholipase A₂ Using Large Scale Sequence Analysis and AI-Based Models

Abstract

Secretory phospholipase A₂ (sPLA₂) hydrolyzes the sn-2 ester bond of phospholipids to generate lysolecithin and free fatty acids, which are valuable in food, cosmetic, and bioprocess applications. However, most microbial sPLA₂s lack sufficient thermostability and catalytic efficiency for high-temperature industrial processes. In this study, a computational discovery– engineering pipeline was established that integrates large-scale sequence collection, phylogenetic clustering, stability prediction, and AI-assisted identification of functionally important residues. Through this pipeline, a thermostable enzyme from Marinactinospora thermotolerans (MtPLA₂) was identified from a curated set of 867 microbial sPLA₂ sequences. MtPLA₂ exhibited markedly enhanced thermal robustness, including a melting temperature of 79.7 °C and retention of more than 70% activity after 5 h at 60 °C. Structural modeling revealed that MtPLA₂ contains an extended C-terminal region that contributes substantially to its stability, as removal of this region resulted in loss of folding and activity. To improve catalytic performance, functionally relevant residues were predicted through evolutionary and structural analysis. Introducing mutations at the catalytic-loop residue Y53 increased product formation at 70 °C. Molecular dynamics simulations showed that the variants exhibited increased loop flexibility, which provides a structural basis for their enhanced catalytic activity. Overall, this work demonstrates that combining evolutionary analysis with AI-guided structural interpretation enables the rational design of thermostable and catalytically improved sPLA₂ enzymes. The MtPLA₂ variants generated in this study provide promising templates for high-temperature lipid bioconversion and illustrate a generalizable framework for engineering industrial biocatalysts.;Secretory phospholipase A₂(sPLA2)는 인지질의 sn-2 위치 에스터 결합을 가수분해하여 라이소레시틴과 지방산을 생성하는 효소로, 식품·화장품·바이오공정 등 다양한 산업 분야에서 활용 가치가 높다. 그러나 대부분의 미생물 유래 sPLA₂는 고온 반응 조건에서 열안정성과 촉매 효율이 충분하지 않아 산업적 적용에 제약이 따른다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 대규모 서열 수집, 계통학적 클러스터링, 안정성 예측, AI 기반 기능 잔기 분석을 통합한 계산 기반 효소 탐색 및 공학 플랫폼을 구축하였다. 이를 통해 총 867개의 미생물 sPLA₂후보군 중에서 Marinactinospora thermotolerans 유래의 고내열성 효소(MtPLA2)를 선별하였다. MtPLA₂는 79.7 °C의 높은 융해온도(Tm)를 나타내었으며, 60 °C에서 5시간 반응 후에도 70% 이상의 활성을 유지하여 기존 미생물 PLA₂보다 우수한 열안정성을 보였다. 구조 모델링 결과 MtPLA2는 확장된 C-말단 구조를 포함하고 있으며, 해당 영역 제거 시 구조적 안정성과 용해성이 크게 저하되는 것으로 확인되어 C말단이 안정성 확보에 핵심적인 역할을 하는 것으로 나타났다. 촉매 활성 향상을 위해 진화 정보와 구조 분석을 기반으로 기능적 중요성을 가지는 잔기를 예측하였고, 촉매 루프에 위치한 Y53의 치환 변이체(Y53F, Y53W)는 70 °C에서 증가된 생성물 생산량을 나타냈다. 또한 분자동역학 시뮬레이션을 통해 이러한 변이가 루프 유연성을 증가시키며 활성 향상과 연관됨을 확인하였다. 종합하면, 본 연구는 진화 기반 분석과 AI 보조 구조 해석을 결합하여 고내열 및 고활성 sPLA₂개발이 가능함을 제시하였다. 본 연구에서 개발된 MtPLA₂변이체는 고온 지질 전환 공정에 유망한 효소로 활용될 수 있으며, 제시된 탐색–공학 전략은 산업용 효소 개발 전반에 적용 가능한 보편적 접근법을 제공한다.