Ice Recrystallization Inhibition using L-alanine/L-lysine Copolymers

Abstract

The ice recrystallization seriously affects quality of biological products such as food, cells, nucleic acids, and vaccines during storages and transportation. Poly(L-alanine-co-L-lysine) (PAK) showed an ice recrystallization inhibition (IRI) activity comparable with poly(vinyl alcohol) (PVA) which is the highest in IRI activity among synthetic polymers. To identify the structure-property relationship of PAK to IRI activity and mechanism of their IRI activity, a series of PAK were synthesized varying 1) composition of A/K over 0/100 (poly(L-lysine), 50/50, 60/40, and 70/30, and 2) molecular weight of PAK varied over 4, 9, and 15 KDa at a fixed 50/50 composition of A/K. Poly(ethylene glycol) and PVA was used as negative and positive controls, respectively. As the hydrophobic L-alanine composition of PAK increased from 0 to 70%, the mean largest grain size (MLGS) relative to phosphate buffered saline, decreased from 74% to 11% at 1.0 mg/ml. As the molecular weight of PAK increased from 4 to 15 KDa, MLGS decreased from 32% to 15% at 1.0 mg/ml. The MLGS of PEG and PVA exhibited 78% and 18% respectively, at 1.0 mg/ml. To conclude, the IRI activity increased as the A/K ratio increased and molecular weight increased. The IRI activity extended to ice nucleation inhibition activity. The ice nucleation temperature lowered as the hydrophobic L-alanine composition of PAK increased and molecular weight of PAK increased. Thermal hysteresis of PAK was about 0.2 oC at 1.0 mg/ml and increased as the molecular weight increased from 4K to 15K. The ice crystal size of ice cream also showed similar trend with IRI activity. To understand the underlying chemistry of the IRI effect of PAK, circular dichroism spectroscopy, dynamic ice shaping study, and FTIR spectroscopy were performed. Poly(L-lysine) is a random coil polymer whereas the PAK has the α-helix as the secondary structure. The magnitude of the α-helicity increased as the A/K ratio and molecular weight of PAK increased. In particular, the α-helix conformation is strengthened as the temperature decreased. Dynamic ice shaping indicated that as the interactions between PAK and ice surface become stronger as the A/K ratio of PAK increased. FTIR spectra of aqueous PAK solution indicated that hydrogen bonding of water is significantly affected during the ice formation. This studies suggested that the α-helicity, hydrophobic/hydrophilic balance, molecular weight of PAK, and strong interactions between the polymers and ice crystals were well-correlated to the IRI activity through the enhanced hydrogen bonding during ice recrystallization.;얼음 재결정화는 저장 및 운송 중 식품, 세포, 핵산 및 백신과 같은 생물학적 제품의 품질에 심각한 영향을 미칩니다. Poly(L-alanine-co-L-lysine) (PAK)은 합성고분자 중 얼음 재결정 억제 활성이 가장 높은 Poly(vinyl alcohol) (PVA)에 필적하는 얼음 재결정 억제 활성을 보였습니다. PAK와 얼음 재결정 억제 활성의 구조-물성 관계 및 얼음 재결정 억제 활성의 기전을 확인하기 위해 1) 알라닌/라이신의 조성 0/100 (poly(L-lysine)), 50/50, 60/40, 그리고 70/30, 2) PAK의 분자량은 고정된 A/K의 50/50 조성에서 4, 9 및 15 KDa으로 다양하게 일련의 PAK를 합성했습니다. Poly(ethylene glycol) (PEG) 및 PVA는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했습니다. PAK의 소수성 L-알라닌 조성이 0에서 70%로 증가함에 따라 인산염 완충용액 (PBS)에 대한 평균 최대 입자 크기 (MLGS)는 1.0 mg/ml 농도 기준, 74%에서 11%로 감소했습니다. PAK의 분자량이 4 KDa에서 15 KDa으로 증가함에 따라 MLGS는 1.0mg/ml 농도 기준, 32%에서 15%로 감소했습니다. PEG 및 PVA의 MLGS는 1.0 mg/ml 농도에서 각각 78% 및 18%를 나타냈습니다. 결론적으로, A/K 비가 증가하고 분자량이 증가함에 따라 얼음 재결정 억제 활성이 증가하였습니다. 얼음 재결정 억제 활성은 얼음 핵 생성 억제 활성으로 확장되었습니다. PAK의 소수성 L-알라닌 조성이 증가하고 PAK의 분자량이 증가함에 따라 얼음 핵 형성 온도는 낮아졌습니다. PAK의 열 이력 현상은 1.0 mg/ml 농도에서 약 0.2 oC 였으며 분자량이 4K에서 15K로 증가함에 따라 함께 커졌습니다. 아이스크림의 얼음 결정 크기도 얼음 재결정 억제 활성과 유사한 경향을 보였습니다. PAK의 얼음 재결정 억제 효과의 기본 원리를 이해하기 위해 원형 편광 이색성 분광법, 동적 얼음 형성 연구 및 푸리에 변환 적외선 분광법을 수행했습니다. Poly(L-lysine) (PK)는 랜덤 코일 폴리머인 반면에 PAK는 2차 구조로 α-나선을 가지고 있습니다. α-나선의 크기는 PAK의 A/K 비율과 분자량이 증가할수록 커졌습니다. 특히, α-나선 구조는 온도가 감소함에 따라 강화됩니다. 동적 얼음 형성은 PAK의 A/K 비가 증가함에 따라 PAK와 얼음 표면 사이의 상호 작용이 더 강해짐을 보여줍니다. PAK 수용액의 푸리에 변환 적외선 스펙트럼 결과에서는 얼음이 형성되는 동안 물의 수소 결합이 크게 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 α-나선성, 소수성/친수성 균형, PAK의 분자량, 폴리머와 얼음 결정 사이의 강한 상호작용이 얼음의 재결정 동안 강화된 수소 결합을 통해 얼음 재결정 억제 활성과 깊은 상관관계가 있음을 시사합니다.