Development of Heterologous Expression System in Streptomycete and Yeast

Abstract

The plant secondary metabolites flavones and stilbenes have demonstrated bioactivity in humans. They exist small quantities in natural sources, but their production levels can be increased by microbial heterologous expression system. As a heterologous host, Saccharomyces cerevisiae is applied as a microbial platform for producing the diverse chemicals from various biosynthetic metabolic pathways. To construct the heterologous biosynthetic pathways in yeast, a multiplex genome-editing system using CRISPR-Cas9 was developed to simultaneously integrate multiple genes by a single transformation. In this study, the heterologous expression system for Streptomyces avermitilis with flavone and stilbene biosynthetic pathway and new yeast genome-editing platform using CRISPR-Cas9 were developed. In Chapter I, the introducing information was described for Chapter II and Chapter III. In Chapter II, the development of heterologous expression system in Streptomyces avermitilis was described for flavone and stilbene production. The recombinant engineered S. avermitilis mutants expressing stilbene or flavone biosynthetic genes consisting of ScCCL (4-coumarate:CoA ligase) and ahSTSop (stilbene synthase) or ScCCL, atCHSop (chalcone synthase), atCHIop (chalcone isomerase), and pcFNSop (flavone synthase), respectively. For more efficient expressions, intergenic region of avermectin PKS from S. avermitilis is added to intergenic region of stilbene or flavone biosynthetic genes. The significant amounts of apigenin (0.5mg/ml) were produced by flavone producing S. avermitilis mutants supplemented with p-coumaric acid. Moreover, this approach to heterologous expression system in S. avermitilis made achieved production of apigenin for the first time. In Chapter III, the development of multiplex genome-editing system by CRISPR-Cas9 in Saccharomyces cerevisiae was described. For the manipulation of gene expression in yeast, selecting optimal loci for integration is one of the most important condition elements. Total eight desirable intergenic loci, located in the highly expressed non-essential genes promoter region, were identified. The characterized CRISPR-mediated GFP integration efficiency of the eight intergenic loci were measured, and double, triple gene integration efficiencies using three genes of betalain biosynthetic pathway were 94.1% and 88.1%, respectively.;플라보노이드(flavonoid)는 식물유래의 이차대사산물로 자외선이나 미생물감염 등으로부터 식물을 보호하는 역할을 한다. 이는 인체내에서 항암, 항산화, 항바이러스 등의 작용을 하여 의약품, 건강기능식품, 화장품 등 상업적으로 널리 이용된다. 이 화합물은 화학합성이 까다롭고 식물에서 직접 추출하기에 함량이 낮고 시간, 공간, 종, 기후 등의 제약이 있어 미생물을 이용한 이종숙주 발현(heterologous expression)을 통해 그 생산량을 높일 수 있다. 진핵생물인 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 인체에 대한 안정성이 보증된 GRAS (Generally Recognized as Safe) 미생물로 다양한 화합물을 생산하는 생합성 대사경로의 미생물 플랫폼으로 널리 사용되고 있다. 생합성 대사경로를 효모내에서 발현하기 위해 염색체 서열 내 정확한 위치를 자르는 크리스퍼-카스9(CRISPR-Cas9)을 이용한 게놈 편집 플랫폼(genome-editing platform)들이 개발되어왔다. 아베르멕틴(avermectin)을 대량 합성하는 상업용 균주 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 SA-01(Streptomyces avermitilis SA-01)를 이종숙주로 플라본과 스틸벤 생합성 유전자집단을 발현하였다. 플라본과 스틸벤을 생합성하는 유전자로 ScCCL (4-coumarate:CoA ligase), ahSTSop (stilbene synthase), atCHSop (chalcone synthase), atCHIop (chalcone isomerase) 그리고 pcFNSop (flavone synthase)를 방선균 코돈에 맞게 최적화(codon-optimized)하여 사용하였다. 각각의 유전자들은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 SA-01의 아베르멕틴 생합성 유전자집단 자리에 치환하였고 아베르멕틴 생합성 유전자 aveA1의 프로모터인 PaveA1을 프로모터로써 사용하였다. 또한 아베르멕틴 생합성 유전자들의 유전자간 영역(intergenic region)의 서열을 각각의 플라본 혹은 스틸벤 생합성 유전자들 사이에 위치시키고 염색체 서열 내 유전자의 방향과 순서를 고려하여 각각의 유전자를 아베르멕틴 유전자 방향에 맞게 재배열하고 생산성을 비교하였다. 그 과정에서 아베르멕틴 생합성 유전자 aveA4의 프로모터인 PaveA4를 추가로 프로모터로써 사용하였다. 그 결과 4-쿠마린산(4-coumaric acid)로부터 0.15 mg/L의 아피제닌(apigenin)이 생산됨을 확인하였고 아베르멕틴 유전자의 유전자간 영역의 서열을 추가로 위치시킨 돌연변이 균주의 생산량(0.5 mg/L)은 약 3.5배 증가하였다. 이는 처음으로 스트렙토마이세스 아버미틸리스에서 아피제닌을 생산한 사례이다. 또한 크리스퍼 카스9을 이용하여 한번의 형질전환(transformation)으로 효모 게놈 내 여러 위치에 여러 개의 유전자를 도입(integration)하는 다중 게놈 편집 플랫폼을 개발하였다. 먼저 방대한 유전자 서열 데이터를 바탕으로 효모 게놈 내 최적의 발현 위치 후보군을 찾고 녹색 형광 단백질(GFP; Green fluorescent protein)을 이용하여 도입효율(integration efficiency)을 측정하였다. 그 결과 고 발현 비 필수 유전자의 프로모터 영역에서 8개의 후보 위치를 선별한 후 각각 위치에 대한 도입효율과 발현 수준(expression level)을 확인하고 성장분석(growth assay)을 통해 외부유전자 도입에 대한 안정성을 평가하였다. 또한 최적의 크리스퍼 카스9 시스템을 선택하기 위해 세가지 플라스미드(plasmid) 시스템을 비교하였고 다유전자 도입(multiple integration)을 위해 운반 RNA (tRNA; transfer RNA)를 이용하여 한 번에 여러 개의 가이드 RNA (gRNA; guide RNA)를 발현하는 플라스미드 시스템을 개발하였다. 이 시스템을 평가하기 위해 단계별 유전자 발현에 따라 노랑색 혹은 붉은색 물질을 생산하는 베타린(betalain) 생합성 유전자 경로를 이용하였다. 그 결과 두개와 세개 유전자 도입효율을 94.1%와 88.1%로 측정되었다. 이 시스템을 응용하면 더 많은 유전자를 필요로 하는 더 복잡한 구조의 유용한 생리활성물질을 대량생산하여 상업적으로 많은 수요를 공급하는데 유리한 안정적인 시스템을 구축할 수 있다.