Biosynthesis of Novel FK506 Analogues and Their Biological Activities as Neuroregenerative Agent Candidates

Abstract

FK506 known as tacrolimus is a polyketide with immunosuppressive activity. It was first discovered in 1984 from Streptomyces tsukubaensis, a microorganism obtained from soil samples collected in the Tsukuba region of northern Japan. It is used as a treatment for autoimmune diseases such as atopic dermatitis. In addition to immunosuppressive activity, FK506 is known to have various pharmacological activities such as antifungal activity, neuroregenerative activity and hair growth activity. However, it is difficult to use other pharmacological activity directly because of immunosuppressive activity. Therefore, this study aimed to produce novel analogues that can utilize other pharmacological activity of FK506 through combinatorial biosynthetic engineering. In addition, we tried to establish the structure-activity relationship (SAR) through the evaluation of biological activities for FK506 analogues. Chapter I gave a brief overview of polyketides including immunosuppressant FK506. The Materials and Methods section of Chapter II provides technical information to generate deletion (or) recombinant mutants of biosynthetic genes and isolate the novel FK506 analogues. In Chapter III, a wide range of chemical approaches have been carried out to produce novel analogues with the C1 / C9, C21, and C31 modifications. Based on previous studies, modifications at C1 or C9 were accomplished by deleting FkbD (cytochrome P450 hydroxylase), and the deletion of FkbM (methyl transferase) was used to generate 31-O-demethyl analogues. In addition, the C21 side chain of FK506 was modified by in-frame deletion of TcsB or TcsD, generating methyl-, ethyl-, and propyl- side chains. Mutant strains were constructed by combining the respective genes, and the structures of FK506 analogues were identified by separation and purification after cultivating each strain. A total of nine FK506 analogues were isolated, seven of which were new compounds. Moreover, each analogue was evaluated for its T-cell cytotoxicity, immunosuppressive activity, and neurite outgrowth assay in vitro. All nine derivatives showed lower cytotoxicity and immunosuppressive activity than FK506. All of the FK506 analogues exhibited neuronal regeneration in in vitro neurite outgrowth assay. Interestingly, the immunosuppressive activity was most reduced when the C9 and C31 positions associated with FKBP-binding region were modified. However, FK506 analogues with C9 modification had the most enhanced neurite outgrowth. Structural modification of the C21 position, which is associated with CaN binding, showed that when the side chain contained short side chain instead of allyl side chain, the immunosuppressive activity was most reduced but neurite outgrowth was most increased in vitro. The results showed that this combinatorial approach could be used to expand the structural diversity of FK506 and to develop new drugs with improved therapeutic properties. In addition, alteration of FK506 at the C9 / C21 or C9 / C21 / C31 positions decreased the immunosuppressive activity but increased the neurite outgrowth in vitro. In Chapter IV, the prolylFK506 analogues were generated by combinatorial biosynthesis. In addition, the SAR of the FK506 analogues was established based on the immunosuppressive and nerveregenerative activities. Two deletion mutants were constructed by additionally deleting the fkbL gene associated with the pipecolate ring at the C1 position from the mutant strains generated in Chapter III. Each strain was cultivated to isolate and purify the biosynthetic derivatives, thereby elucidating the structures of the four novel prolylFK506 analogues. For the evaluation of biological activities, all four prolyl analogues showed significantly lower cytotoxicity and immunosuppressive activity than FK506. Moreover, FK506 analogues containing modified C1, C9, C21, and C31 positions showed significantly lowest IC50 value for immunosuppression compared to FK506 analogues modified at the C9 or C9 / C31 positions selected in Chapter III. All prolylFK506 analogues except for 9-deoxo-prolylFK520 (12), reduced neurite outgrowth compared to FK506. Furthermore, it was showed that several prolyl analogues have synaptic transmission ability. In particular, 9-deoxo-prolylFK520 (12) showed the most improved nerve growth among the analogues produced in Chapter III and IV. Taken together, these results demonstrated that 9-deoxo-prolylFK520 (12) the potential candidate for the treatment of neuronal diseases. In Chapter V, the site-directed mutagenesis has been performed to biosynthesize the altered C9 analogues. The C9 position of FK506 is important for distinguishing FKBP51 and FKBP52, which are the targets of neuronal regeneration as well as biological activity. The AT10 domain associated with the C9 position of the FK506 was engineered to accept various extender units instead of malonyl-CoA at the C9 position. The AT domains known to accept ethylmalonyl-CoA or methoxymalonyl-ACP were aligned, and point mutation of amino acids that were expected to affect substrate specificity were accomplished. The two AT10 recombinant strains were constructed and each strain was cultivated to produce three new FK506 analogues. 9-deoxo-9-ethylFK506 (15) was identified in V90Q mutant strain which mutated valine to glutamine. In addition, 9-deoxo-9-ethyl-FK506 (15), 9-deoxo-9-methyl-FK506 (16), and 9-deoxo-9-methoxy-FK506 (17) were identified in the F188G mutant strain which mutated phenylalanine to glycine mutation. In summary, the detailed understanding of the SAR for the FK506 analogues allowed us to develop new drug candidate, leading the possibility for the new nerveregenerative agent. ;타크롤리무스로도 알려진FK506은 면역억제활성을 가지고 있는 마크로라이드 (macrolide) 계 폴리케타이드로 1984년 일본 북부지방 쯔꾸바 지역에서 채취된 흙 시료로부터 얻은 미생물인 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 (Streptomyces tsukubaensis)로 부터 처음 생산되었다. 1994년도에 미국 FDA의 승인을 받은 이후로 장기 이식 환자의 이식거부반응 예방과 아토피성 피부염과 같은 자가면역질환의 치료제로 널리 사용되고 있다. FK506은 면역억제활성 이외에도 항진균활성, 신경재생활성 및 발모활성 등 다양한 약리활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 그러나 면역억제활성 때문에 직접적으로 다른 약리활성을 이용하는데 어려움이 있다. 이에 본 연구는 생합성 유전자 조합을 통해 FK506의 다른 약리활성을 이용할 수 있는 신규 유사체를 생산하고자 하였다. 또한 생산된 유사체의 활성 평가를 통해 구조-활성 상관 관계를 규명하고자 하였다. 본 논문의 3장에서는 탄소1번/탄소9번, 탄소21번, 그리고 탄소31번 위치가 변형된 신규 유사체를 제작하고자 광범위한 화학 변형이 수행되었다. 선행연구를 바탕으로, FkbD (사이토크롬 P450 수산화효소)를 결실시킴으로써 탄소1번 또는 탄소 9 번 위치에서의 변형을 수행하였고, 31-O-데메틸 유도체를 생성하는데 FkbM (메틸 전이 효소)의 결실을 이용하였다. 또한, FK506의 탄소 21번 위치에서의 측쇄는 TcsB 또는 TcsD의 프레임 내 삭제 (in-frame gene deletion)에 의해 변형되었다. 즉, 각 유전자를 조합하여 결실 돌연변이 균주를 제작하고, 각 균주들의 발효액에서 생합성되는 유사체를 분리∙정제하여 구조를 동정하였다. 총 9 개의 FK506 유사체가 분리되었으며, 그 중 7 개가 새로운 화합물이었다. 또한, 각 유사체의 세포독성, 면역억제 활성, 그리고 신경재생 활성을 측정하였다. 9 종의 유사체 모두 FK506보다 낮은 세포독성 및 면역억제 활성을 나타내었다. 그리고 시험관 내 신경돌기 성장 길이 측정을 통해 FK506 유사체 모두 신경재생 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, 에프케이비피 (FKBP) 결합 영역의 구조적 변형에 따른 면역억제 활성은 FK506의 탄소 9번과 탄소31번 위치를 함께 변형시킬 때 가장 많이 감소하였음을 확인하였다. 신경돌기 성장률은 탄소 9번 위치 변형 시 가장 많이 증가하였다. 칼시뉴린 (CaN) 결합 영역의 구조적 변형에 따르면 탄소 21 번 위치에 있는 알릴 측쇄 대신 사슬이 짧은 메틸기를 내포할 때 면역억제 활성이 가장 감소하고, 신경 길이는 가장 증가함을 나타냈다. 본 연구결과는 이러한 조합생합성 접근법이 FK506의 구조적 다양성을 확장하고 향상된 치료 특성을 갖는 신규 약제를 개발하는데 사용될 수 있음을 보여주었다. 또한 이 결과는 FK506의 탄소9번과 탄소 21번 위치를 변형하거나 탄소 9번, 탄소 21번, 그리고 탄소 31번의 위치를 변형할 때, 면역억제 활성은 매우 감소하지만 신경돌기 성장은 더욱 증가함을 제공하였다. 본 논문의 4장에서는 신경 재생능은 유지되고 면역억제 활성은 더욱 감소된 프로릴FK506 유사체를 개발하고, 면역 억제 및 신경돌기 성장 활성 평가를 수행하여 유용 생리활성 물질로의 활용이 가능함을 확인하였다. FK506의 탄소1번 위치에서 피페콜레이트 생성에 관여하는 fkbL 유전자를 결실 시킴으로써 프로릴 고리를 생성하였으며, 포스트-PKS 변형 및 알릴 측쇄 형성에 관여하는 유전자 결실을 통해 2 종의 돌연변이 균주를 제작하였다. 제작된 돌연변이 균주의 발효액에서 생합성된 유도체를 분리∙정제 하였고, 구조 동정을 통해 4 종의 새로운 FK506 유사체를 획득하였다. 그리고 4 종의 FK506 유사체의 세포독성, 면역억제 활성, 그리고 신경재생 활성을 측정하였다. 4 종의 유사체 모두 FK506보다 대폭 감소된 세포독성 및 면역억제 활성을 나타내었다. 또한 에프케이비피 (FKBP) 결합 영역의 구조적 변형에 따른 면역억제 활성은 3장에서 선택된 탄소9번 위치 변형 또는 탄소9번과 탄소 31번 위치 변형한 유사체보다 대폭 감소하였으며, 탄소1번, 탄소9번, 탄소 21번, 그리고 탄소31번 위치를 변형할 때 가장 낮은 면역억제 활성을 나타냈다. 그리고 9-deoxo-prolylFK520을 제외하고는, 프로릴 유사체 모두 FK506보다 낮은 신경돌기 길이 성장을 나타내는 것을 확인하였다. 나아가 일부의 프로릴 유사체가 시냅스 전달 능력을 가지고 있음을 확인하였다. 특히, 9-deoxo-prolylFK520은 본 논문의 3장과 4장에서 생산된 유사체들 중 가장 향상된 신경돌기 성장을 나타내었다. 종합하면, 9-deoxo-prolylFK520이 새로운 신경재생제로의 가능성이 가장 높다고 판단된다. 마지막으로 본 논문의 5장은 부위 지향적 돌연변이 유발을 통해 생합성된 FK506 유사체들을 확인한 연구를 다루고 있다. FK506의 탄소9번 위치는 생물학적 활성과 더불어 신경 재생의 목표인 FKBP51과 FKBP52를 구별하는 데 중요한 위치이다. 이에 본 장에서는 FK506의 탄소9번 위치에 관여하는 AT 10번 도메인을 조작하여 malonyl-CoA 대신 다양한 extender unit을 받아들이고자 하였다. Ethylmalonyl-CoA 또는 methoxymalonyl-ACP를 받아들이는 것으로 알려진 AT 도메인들을 정렬하였고, 기질 특이성에 영향을 줄 것이라 예측되는 아미노산을 선별하여 점 돌연변이 시켰다. 2종의 AT10 재조합 균주를 제작하였으며, 각 균주를 배양하여 3종의 새로운 FK506 유도체들을 생산하였다. 발린 80번을 글루타민으로 바꾼 돌연변이 균주에서 9-deoxo-9-ethyl-FK506이 생산되는 것을 MS-MS로 확인하였다. 또한 페닐알라닌 188번을 글라이신으로 바꾼 돌연변이 균주에서 9-deoxo-9-methyl-FK506, 9-deoxo-9-ethyl-FK506, 그리고 9-deoxo-9-methoxy-FK506을 확인하였다. 이상의 연구결과는 폴리케타이드 계열 화합물인 FK506의 생합성 유전자 조합을 통해 다양한 유사체를 생산하고, 다양한 활성평가를 이용한 강력한 신경재생제 후보 물질 선별에 관한 보고이다. 이와 같은 조합생합성 방법은 FK506뿐만 아니라 화학적 합성이 어려운 마크로라이드 구조 (macrolide scaffold)의 구조적 다양성을 확장하였다. 또한 FK506 유사체에 대한 구조-활성 상관관계는 향후 신규 신약후보물질을 효율적으로 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 예상된다.