A single-domain Antibody Library Based on a Stability-Engineered Human VH3 Scaffold

Abstract

Full-length IgG monoclonal antibodies demonstrate excellent quality as a therapeutic modality and constitute the majority of approved monoclonal antibody therapeutics. Despite their many advantages, several disadvantages of standard IgG molecules are also known, the most notable being high cost and time-consuming production in mammalian cell lines. Single domain antibodies (sdAbs) are the smallest functional antibody format (~15kDa) and represent a viable alternative to IgG in many applications. However, unlike naturally single-domain antibodies such as camelid VHHs, the variable domains of conventional antibodies show poor physicochemical properties when expressed as sdAbs, with the aggregation of the VH domain being a major issue preventing the broader application of this technology. To address this problem, a strategy involving three main steps was employed: (1) a framework region 2 (FR2)-randomized library was constructed, and a stable VH domain was obtained by panning with Protein A, which specifically binds to human VH3; (2) additional amino acid substitutions were introduced to improve the biophysical properties of the isolated VH scaffold; and (3) the quality of the modified VH scaffolds was assessed to determine their tolerance to CDR diversity introduction, with further amino acid substitutions applied to enhance the solubility of the VH domain. As a result, a VH domain scaffold demonstrating excellent physical properties was selected. Stable sdAb variants of human VH3-23 were identified from an FR2-randomized human VH library through phage display selection under thermal challenge. Synthetic complementarity-determining region (CDR) diversity was introduced to one of the selected variants, which exhibited high thermal stability, expression levels, and monomeric content, to construct a human VH sdAb library. This library was validated by panning against a panel of antigens, and target-specific binders were identified and characterized for their affinity and biophysical properties. These results suggest that a synthetic sdAb library based on a stability-engineered human VH scaffold could be a practical source of high-quality sdAbs for various applications.;전통적인 면역글로블린 (IgG) 단일 클론 항체는 치료제로서 우수한 품질을 보여주며 승인된 단일 클론 항체 치료제의 대부분을 차지하고 있습니다. 여러 가지 장점에도 불구하고, 기존 IgG 분자에는 몇 가지 단점이 잘 알려져 있습니다. 그 중 가장 주목할 만한 것은 높은 비용과 포유류 세포주에서의 시간 소모적인 생산 과정입니다. 단일 도메인 항체 (single domain Abs, sdAbs)는 가장 작은 기능성 항체 형식 (크기: 15kDa)으로, 많은 응용 분야에서 IgG의 실질적인 대안이 될 수 있습니다. 그러나, 낙타과 VHH (Camelid-derived VHH)와 같은 자연적으로 발생하는 단일 도메인인 항체와는 달리, 기존 항체의 가변 도메인은 단일 도메인 항체(sdAb)로 발현될 때 물리화학적 특성이 좋지 않은 것으로 나타났습니다. 중쇄 단일 도메인(VH)의 응집(aggregation) 문제는 이 기술의 광범위한 응용을 방해하는 주요 장애물이었습니다. 이 문제를 해결하기 위한 전략은 다음의 세가지 주요 단계로 구성되었습니다. 첫째, 프레임워크 영역 2 – 무작위화 라이브러리를 구축하고 인간 VH3에 특이적으로 결합하는 단백질 A를 사용한 선별을 통해 안정적인 중쇄 단일 도메인(VH)을 얻었습니다. 둘째, 분리된 중쇄 단일 도메인(VH) 스캐폴드의 생물물리학적 특성을 향상시키기 위해 추가적인 아미노산 치환을 도입하였습니다. 셋째, 수정된 중쇄 단일 도메인(VH) 스캐폴드의 품질을 평가하여 CDR 다양성 도입에 대한 내성을 결정하였습니다. 그런 다음, 중쇄 단일 도메인(VH)의 용해성을 높이기 위해 추가적인 아미노산 치환이 적용되었습니다. 그 결과, 우수한 생물물리학적 특성을 보여주는 중쇄 단일 도메인(VH) 스캐폴드를 선택하였습니다. 결론적으로 열 충격 하에서 파지 디스 플레이 선별을 통해 프레임워크 2 – 무작위화 인간 중쇄 단일 도메인(VH) 라이브러리에서 인간 VH3-23 생식세포계열의 안정적인 단일 도메인 변형체를 식별하였습니다. 합성 상보성 결정 영역 (CDR) 다양성은 높은 열 안정성, 발현 수준 및 단량체 함량을 가진 선택된 변형체 중 하나에 도입되어 인간 VH 단일 도메인 라이브러리를 구축하였습니다. 라이브러리는 항원 패널에 대한 선별을 통해 검증되었으며, 표적 특이적 결합체가 확인되어 그 친화력 및 생물물리학적 특성이 특징지어졌습니다. 연구 결과는 안정성-공학적 인간 중쇄 단일 도메인(VH) 스캐폴드를 기반으로 한 합성 단일 도메인 라이브러리가 많은 실용적 응용을 위한 고품질 단일 도메인의 간편한 소스가 될 수 있음을 시사합니다.