Biosynthesis of Di-/Tri-Hydroxy Fatty Acids by Using Linoleate Diol Synthases as Key Enzymes

Abstract

Hydroxy fatty acids (HFAs) have significant scientific and industrial importance. Here, we designed various biosynthetic pathways to produce novel Di- and Tri-HFAs from renewable fatty acids, primarily using linoleate diol synthases (LDSs) as key enzymes. LDS is a fusion protein comprising a 8-dioxygenase (DOX) domain and a regiospecific P450/hydroperoxide isomerase (HPI) domain. Based on the regiospecificity of the HPI domains, LDSs are categorized into 5,8-LDS, 6,8-LDS, 7,8-LDS, and 8,11-LDS. For instance, Di-HFAs and Tri-HFAs were successfully produced through LDS-based biotransformation of ricinoleic acid (12-hydroxyoctadec-9Z-enoic acid, 12-HOME) and 13-hydratase-based linoleic acid-derived 13-hydroxyoctadec-9Z-enoic acid (13-HOME). Notably, the biotransformation activities were dependent on the structure of the reaction substrates. Through in silico docking simulations, it was observed that reactive substrates formed effective interactions with catalytic residues, enabling the reaction, while non-reactive substrates lacked these interactions, preventing the reaction. Additionally, G-protein-coupled receptors (GPRs) activation levels were found to correlate with the number of interactions between the substrate and the receptor. Ca²⁺ mobilization assays were conducted to evaluate biological activity of novel HFAs on GPR40 and GPR120, long-chain free fatty acid receptors expressed in various tissues and involved in diverse physiological functions. In particular, 8,12-dihydroxyoctadec-9Z-enoic acid (8,12-DiHOME) derived from 12-HOME via LDSs emerged as a promising novel bioactive molecule, exhibiting high activity on GPR120. To further investigate the role of the hydroxy group position in HFAs on GPR120 activation, ligand docking simulations were conducted. The results showed that 8,12-DiHOME formed an additional hydrogen bond with an amino acid residue in the ligand-binding pocket, which enhanced its activity on GPR120. This study contributes to the successful biosynthesis of novel bioactive compounds.;하이드록시 지방산(Hydroxy Fatty Acids, HFAs)은 과학적 및 산업적으로 중요한 물질입니다. 본 연구에서는 리놀레이트 디올 합성효소(Linoleate Diol Synthases, LDSs)를 핵심 효소로 활용하여 재생 가능한 지방산으로부터 신규 Di-HFA 및 Tri-HFA를 생산하기 위한 다양한 생합성 경로를 설계하였습니다. LDS는 8-디옥시게나아제(DOX) 도메인과 위치 특이적 P450/하이드로퍼옥사이드 아이소머화효소(HPI) 도메인으로 구성된 융합 단백질입니다. HPI 도메인의 위치 특이성에 따라 LDS는 5,8-LDS, 6,8-LDS, 7,8-LDS, 8,11-LDS로 분류됩니다. 예를 들어, Di-HFA 및 Tri-HFA는 리시놀레산과 리놀레산 유래의 13-하이드록시옥타데크-9Z-엔산(13-HOME)을 기반으로 한 LDS 및 13-하이드라타제 기반 생물전환을 통해 성공적으로 생산되었습니다. 특히, 생물전환 활성은 반응 기질의 구조에 의존적임이 확인되었습니다. In silico 닥킹 시뮬레이션 결과, 반응성이 높은 기질은 촉매 잔기와 효과적으로 상호작용하여 반응이 가능했지만, 반응성이 낮은 기질은 이러한 상호작용이 없어 반응이 일어나지 않았습니다. 또한, G-단백질 결합 수용체(G-protein-coupled receptors, GPRs)의 활성화 수준은 기질과 수용체 간 상호작용 수와 상관관계를 보였습니다. GPR40 및 GPR120에 대한 신규 HFA의 생물학적 활성을 평가하기 위해 Ca²⁺ 이동화 분석(Ca²⁺ mobilization assay)을 수행하였으며, GPR40 및 GPR120은 다양한 조직에서 발현되며 여러 생리적 기능에 관여하는 장쇄 자유 지방산 수용체입니다. 특히, 리시놀레산에서 LDS를 통해 유래된 8,12-디하이드록시옥타데크-9Z-엔산(8,12-DiHOME)은 GPR120에서 높은 활성을 나타내는 유망한 신규 생리활성 물질로 확인되었습니다. 신규 HFA에서 하이드록시기 위치가 GPR120 활성화에 미치는 영향을 추가적으로 연구하기 위해 리간드 도킹 시뮬레이션을 수행하였고, 그 결과 8,12-DiHOME이 리간드 결합 포켓 내 특정 아미노산 잔기와 추가적인 수소 결합을 형성함으로써 GPR120에서의 활성이 증대됨을 확인하였습니다. 본 연구는 신규 생리활성 화합물의 성공적인 생합성에 기여합니다.