Molecular Characterization of Oleate Hydratases based on Ancestral Sequence Reconstruction

Abstract

Oleate hydratases (Ohys) catalyze the hydration of unsaturated fatty acids into hydroxy fatty acids, which have diverse physiological functions. However, the Ohys (e.g., the Ohys from Lactobacillus rhamnosus (LrOhys)) exhibited low structural stability. Therefore, the Ohys from Lactobacillus sp. were investigated through ancestral sequence reconstruction (ASR). ASR indicated that the Ohys from Lactobacillus sp. were diverged into two major clades: Fam2 and Fam3. Interestingly, the Ohys in Fam3 appeared to exist as a monomeric form including Met as a catalytic residue, whereas the Fam2 enzymes exist as a dimeric form having Glu as a catalytic residue. The evolutionary intermediates predicted based on the extant Ohys have shown greater stability and long-term biotransformation activity compared to the extant enzymes. For instance, the G456D variant ancestor of LrOhy (LrANCG456D) showed 30% higher activity and thermal stability than the extant enzymes. Furthermore, an ancestral enzyme of Fam3 Ohys (Fam3_ANC) exhibited the greater stability and activity than the LrANC. The oleic acid hydration activity of Fam3_ANC reached 15.0 U/g cells. This study will contribute to understanding and engineering of the Ohys from Lactobacillus.;올레산 수화효소는 불포화 지방산을 수화 지방산으로 수화하는 효소로, 다양한 생리적 기능을 가지고 있습니다. 그러나 Lactobacillus rhamnosus에서 유래한 Ohy (LrOhy)와 같은 Ohy는 낮은 구조적 안정성을 보였습니다. 따라서 Lactobacillus 속의 Ohy에 대해ancestral sequence reconstruction (ASR)을 통해 연구를 진행했습니다. ASR분석 결과, Lactobacillus 속 Ohy는 두 개의 주요 계통군인 Fam2와 Fam3으로 분화된 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, Fam3에 속한 Ohy는 모노머 형태로 존재하며, 그 촉매 잔여물로 메티온인(Met)을 가지고 있는 반면, Fam2에 속한 효소는 다이머 형태로 존재하며, 글루탐산(Glu)을 촉매 잔여물로 가지고 있었습니다. 현재 존재하는 Ohy들을 기반으로 예측된 진화적 중간체들은 기존 효소들에 비해 더 높은 안정성과 장기적인 생물전환 활성을 보였습니다. 예를 들어, LrOhy의 G456D 변이 조상(LrANCG456D)은 기존 효소들보다 30% 더 높은 활성과 열적 안정성을 보였습니다. 또한, Fam3 Ohy의 조상 효소(Fam3_ANC)는 LrANC보다 더 높은 안정성과 활성을 나타냈습니다. Fam3_ANC의 올레산 수화 활성은 15.0 U/g 세포에 달했습니다. 본 연구는 Lactobacillus 속 Ohy의 이해와 엔지니어링에 기여할 것입니다.