Validation of Small Molecule Inhibitor Targeting Biofilm Formation Regulator CsgD Across Multiple Pathogens

Abstract

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections are a major public health concern due to rising antibiotic resistance and limited treatment options. This study identifies Curlexin (A4) as a selective inhibitor of CsgD, a key transcriptional regulator in EHEC biofilm formation and virulence. Using an optimized high-throughput screening (HTS) system—featuring a deletion within the csgBAC-csgDEFG operon and a CsgD-activated reporter—8,201 compounds were screened anda Curlexin was identified as an effective CsgD inhibitor. Bioluminescence assays showed that Curlexin reduces CsgD activity without affecting bacterial growth, thus lowering selective pressure for resistance. Curlexin was shown to inhibit biofilm formation, bacterial adhesion, and host cell invasion in EHEC strain EDL933. Mechanistic studies indicated that Curlexin reduces curli protein, decreases csgA and csgB transcription, and lowers CsgD protein levels. Additionally, site-directed mutagenesis revealed critical residues (Y130 and Q133) within CsgD essential for function and Curlexin binding, with Y130W mimicking an inactive form of CsgD. This structural insight supports future development of targeted CsgD inhibitors. Curlexin demonstrated effectiveness across various pathogens, including Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, and Vibrio vulnificus, suggesting that CsgD homologs could be universal anti-biofilm targets. Overall, Curlexin offers a promising approach for controlling EHEC and other biofilm-associated pathogens, providing a novel, sustainable alternative to antibiotics with minimal risk of resistance development.;장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC) 감염은 항생제 내성 증가와 제한된 치료 방법으로 인해 심각한 공중보건 문제로 주목받고 있다. 본 연구에서는 EHEC의 바이오필름 형성과 병원성 조절에서 중요한 역할을 하는 전사 조절 단백질인 CsgD를 선택적으로 억제하는 화합물인 Curlexin을 도출하였다. 이를 위해, csgBAC-csgDEFG 오페론을 삭제하고 CsgD 활성화 리포터 시스템을 포함하는 최적화된 고효율 선별 시스템(HTS)을 구축하여 8,201개의 화합물을 스크리닝한 결과, Curlexin이 효과적인 CsgD 억제제로 확인되었다. 생체발광 분석 결과, Curlexin은 세균 성장에는 영향을 미치지 않으면서 CsgD 활성을효과적으로 감소시켜 내성 발달을 낮추는 것으로 나타났다. Curlexin은 EHEC strain EDL933의 바이오필름 형성을 억제하고, 세균의 부착 및 숙주 세포 침입을 유의미하게 감소시켰다. 추가적인 기작 연구를 통해, Curlexin이 CsgD의 이합체화(dimerization) 형성을 방해하고, csgA와 csgB 전사를 억제하며, CsgD 단백질 수준을 낮추는 작용을 한다는 사실이 확인되었다. 이를 통해 Curlexin이 CsgD의 기능적 활성화를 저해하는 다중적 기전을 가지고 있음을 밝혔다. Site-directed mutagenesis를 활용한 연구에서는 CsgD의 Y130과 Q133 잔기가 단백질 기능과 Curlexin 결합에 중요한 역할을 한다는 점을 규명하였다. 특히, Y130W 돌연변이는 비활성화된 형태의 CsgD를 모방하는 것으로 나타났으며, 이러한 구조적 통찰은 향후 CsgD를 표적으로 하는 억제제 설계에 중요한 기초 자료를 제공한다. 더 나아가, Curlexin은 Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Vibrio vulnificus 등 다양한 병원성 균주에서도 바이오필름 억제 효과를 보였으며, 이는 CsgD 유사체가 다양한 세균 병원체에서 공통적으로 효과적인 항바이오필름 표적이 될 가능성을 시사한다. 본 연구는 Curlexin이 EHEC 및 기타 바이오필름 관련 병원균을 제어하기 위한 지속 가능한 항생제 대안으로서 활용 가능성을 보여주었다. 더불어, Curlexin은 내성 발달의 위험을 최소화하면서도 효과적인 항바이오필름 제제로서 향후 다양한 분야에서 활용될 수 있는 잠재력을 지니고 있음을 입증하였다.