Development of an HPLC-PDA Method for Sucralose via p-Nitrobenzylation and Its Application to Processed Foods

Abstract

수크랄로스는 화학적으로 합성된 비영양성 감미료로 비만 예방, 당뇨병 환자의 혈당 조절, 충치 예방 등 다양한 이점이 있다. 그러나 안전성 논란과 부작용 우려가 지속적으로 제기되어 식품 중 함량 및 노출량 모니터링의 중요성이 부각되고 있다. 현재 수크랄로스 함량 분석을 위한 공인된 시험법이 부재하여 섭취량 관리가 어려운 실정이며, 이러한 문제를 해결하고자 다양한 기기 분석법이 연구되고 있다. 기존 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 기반 분석법은 굴절검출기 (RID)의 낮은 감도, 증발광산란검출기 (ELSD)의 직선성 문제, 이차질량분석기 (MS/MS)의 높은 초기 비용 등 한계가 있었다. 이러한 한계를 극복하고 더 신뢰성 있는 분석법을 확립하기 위해, 4-Nitrobenzoyl chloride (p-NBC)를 이용한 수크랄로스 유도체화 방법과 HPLC-Photodiode Array Detector (PDA)를 기반으로 한 분석법을 최적화하였다. 30% 에탄올로 식품에서 수크랄로스를 추출한 뒤, 10% p-NBC/pyridine을 사용해 50℃에서 60분간 유도체화하였다. 유도체화된 시료는 silica Sep-Pak cartridge로 정제 후, acetonitrile에 용해하여 표준용액을 조제하였다. 분석에는 UK-Phenyl 컬럼 (4.6 × 250 mm, 3 μm)을 사용하였으며, 검출 파장은 260 nm, 이동상은 65% acetonitrile/distilled water (등방성, isotonic), 컬럼 온도는 40℃, 유속은 1 mL/min, 주입량은 10 μL로 설정하였다. HPLC-PDA 분석법의 유효성 검증을 위해 빵류, 탄산음료, 발효유를 매트릭스로 설정하여 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 (LOD), 정량한계 (LOQ)를 평가하고 교차검증을 수행하였다. 분석 결과, HPLC-PDA는 뛰어난 직선성 (R² ≥0.9999)을 보였으며, 정확성은 일내 96.24-106.83%, 일간 98.94-106.20%로 나타났다. 정밀성은 일내 0.11-2.36%, 일간 0.18-2.34%로 우수하였고, 검출한계 (LOD)는 0.12-0.16 mg/kg, 정량한계 (LOQ)는 0.35-0.47 mg/kg으로 나타났다. 교차검증 결과, 높은 회수율 (98.94-105.19%)과 낮은 상대 표준편차 (RSD: 0.14-4.47%)가 확인되었으며, 이 결과는 분석법의 재현성과 신뢰성을 입증하였다. 이러한 결과는 Association of Official Analytical Chemists (AOAC) 및 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation (NIFDS) 가이드라인을 충족하며, 기존 HPLC-RID 및 ELSD 분석법에서 발생할 수 있는 정확도, 정밀도, 직선성의 한계를 효과적으로 극복한 성과를 보여준다. 분석법을 국내 유통 7개 식품유형 (캔디류, 과자, 발효유, 빙과, 과·채음료, 유산균음료, 가공유)의 212개 제품에 적용한 결과, 수크랄로스 함량은 0.15-157.77 mg/kg 범위였다. 국내산 제품은 7가지 식품유형 모두에서 수거되었으나, 수입산 제품은 캔디류, 과자, 과·채음료 세 가지 식품유형에서만 수거되었다. 국내산 식품의 평균 수크랄로스 함량은 캔디류에서 가장 낮은 7.47 mg/kg, 유산균음료에서 가장 높은 89.04 mg/kg으로 나타났다. 수입산 식품의 경우 캔디류 (17.13 mg/kg)와 과·채음료 (35.98 mg/kg)에서 각각 최솟값과 최댓값을 보였다. 모든 제품은 General Standard for Food Additives (GSFA), 캐나다, 일본 및 한국 식품첨가물공전의 기준을 초과하지 않았다. 본 연구는 p-NBC 유도체화법을 기반으로 한 HPLC-PDA 정량 분석법을 새롭게 확립하여, 수크랄로스의 안전한 관리 체계 구축에 기여할 수 있는 실질적이고 신뢰성 높은 분석 도구를 제시하였다. 이 연구는 소비자 기호를 반영한 제품 개발뿐만 아니라, 인공감미료의 안전성과 섭취 기준 마련을 위한 과학적 근거를 제공하며, 수크랄로스의 효과적이고 안전한 관리에 기여할 것으로 기대된다.;Sucralose is a chemically synthesized non-nutritive sweetener with various benefits, including obesity prevention, blood glucose regulation in diabetic patients, and cavity prevention. However, concerns regarding its safety and potential side effects have been persistently raised, emphasizing the need for reliable instrumental techniques to manage its intake. The lack of an officially recognized analytical method for sucralose has necessitated the development of such techniques. Existing High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods for sucralose analysis use detectors such as Refractive Index Detector (RID), Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), and Tandem Mass Spectrometry (MS/MS). However, RID has low sensitivity, ELSD shows poor linearity, and MS/MS requires high initial costs. To overcome these challenges, a derivatization method using 4-Nitrobenzoyl chloride (p-NBC) with HPLC-Photodiode Array Detector (PDA) was optimized. Sucralose was extracted from food products with 30% ethanol and derivatized with 10% p-NBC in pyridine at 50°C for 60 minutes. The derivatized product was purified using a silica Sep-Pak cartridge with ethyl acetate, then dissolved in acetonitrile to prepare a standard solution. Analysis was performed on a UK-Phenyl column (4.6 × 250 mm, 3 μm) at 260 nm, with a mobile phase of 65% acetonitrile/distilled water (isocratic) delivered at 1 mL/min, a column temperature of 40°C, and an injection volume of 10 μL. To validate the HPLC-PDA method, bread, carbonated beverages, and fermented milk were analyzed for linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), and inter-laboratory cross-validation. The method demonstrated excellent linearity (R² ≥ 0.9999) and accuracy ranging from 96.24 to 106.83% (intra-day) and 98.94 to 106.20% (inter-day). Precision ranged from 0.11 to 2.36% (intra-day) and 0.18 to 2.34% (inter-day). The LOD ranged from 0.12 to 0.16 mg/kg, and the LOQ from 0.35 to 0.47 mg/kg. Cross-validation confirmed high recovery (98.94 to 105.19%) and low relative standard deviations (RSD: 0.14 to 4.47%), ensuring reproducibility. These results comply with the guidelines of the Association of Official Analytical Chemists (AOAC) and the National Institute of Food and Drug Safety Evaluation (NIFDS), overcoming the limitations of HPLC-RID and ELSD methods. The method was applied to 212 food products from seven categories: candies, confectioneries, fermented milks, frozen confectionery products, fruit/vegetable beverages, lactic acid bacteria beverages, and processed milks. Sucralose content ranged from 0.15 to 157.77 mg/kg. Domestic samples included all categories, while imported samples were limited to candies, confectioneries, and fruit/vegetable beverages. Sucralose levels in domestic products ranged from 7.47 mg/kg in candies to 89.04 mg/kg in lactic acid bacteria beverages. Imported products had the lowest levels in candies (17.13 mg/kg) and the highest in fruit/vegetable beverages (35.98 mg/kg). All products complied with the sucralose limits set by the General Standard for Food Additives (GSFA) and the regulations of Canada, Japan, and Korea. This study developed a reliable HPLC-PDA method for precise sucralose quantification in foods, optimized with p-NBC derivatization. The method provides a practical solution for creating consumer-focused products and ensuring safe sucralose management. Additionally, the findings offer a scientific basis for establishing intake guidelines and shaping future regulatory policies for artificial sweeteners.