Discovering Novel Adeno-Associated Virus Variants by Directed Evolution for Targeted Gene Therapy of Osteoarthritis

Abstract

골관절염은 관절 연골의 소실을 특징으로 하는 질환이며, 고령 인구를 대상으로 발생 빈도가 매우 높은 대표적인 퇴행성 질환이다. 때문에 골관절염의 성공적인 치료를 위해서 다양한 치료법이 연구되고 있다. 현재 가장 주목받고 있는 세포 치료법, 그 중에서도 줄기세포 치료법 같은 경우 줄기세포를 주입한 뒤 이 줄기세포가 연골세포로 직접 분화하여 소실된 연골을 대신하여 재생하는 것을 목표로 하고 있다. 그러나 큰 관심 및 가능성에도 불구하고, 줄기세포 치료제는 주입된 세포가 소실되고, 낮은 연골 분화 효능을 보이는 등 여러 가지 제한점들을 가지고 있다. 따라서 바이러스, 나노 입자 등의 유전자 전달 벡터를 활용한 다양한 유전자 치료 전략들이 골관절염 치료를 위해 제안되고 있다. 이러한 전달 벡터 중 바이러스 벡터군에 속하는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터는 병원성이 없고 면역원성이 낮아 안전성이 높고, 장기간 유전자 발현을 가능케 한다. 뿐만 아니라 높은 전달 효율을 가지고 있으므로 다양한 유전자 치료 응용 분야에서 주목받고 있다. 본 연구에서는 연골 재생을 촉진할 수 있는 AAV 기반 유전자 치료법을 개발하는 것을 목표로 한다. AAV는 혈청형마다 각기 다른 조직 특이성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 표적 조직의 종류에 따라 도입 효율의 차이를 보인다. 따라서 본 연구에서는 GFP 리포터 유전자를 탑재한 AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 바이러스를 생산하여 연골 세포 C28/I2와 다른 세포 유형에서의 혈청형에 따른 감염성을 비교했다. 하지만 자연적으로 존재하는 야생형 AAV 같은 경우, 이들 세포에서 표적 조직으로의 선택적이고 효과적인 유전자 전달을 달성하기에 충분하지 않음이 입증되었다. 따라서 본 연구에서는 캡시드 엔지니어링 기법을 활용하여 연골 세포에 효과적인 조직 특이성을 가지고 있다고 알려진 AAV8을 기반으로 펩타이드 라이브러리를 개발하고자 한다. 조직 특이성에 관여한다고 알려져 있는 캡시드 부분에 무작위의 캡시드를 삽입하여 개발된 AAV 라이브러리를 기반으로 두 번의 스크리닝 과정을 진행하여 연골 세포에 가장 효과적인 형질 도입 효율을 보이는 서열을 선별하고자 한다. 이는 효과적인 약물 전달 도구로서 원하는 표적 조직인 연골 세포로의 형질 도입 효율을 극대화시킬 수 있을 것으로 기대된다.;Osteoarthritis (OA) is characterized by the loss of articular cartilage and is a representative degenerative disease with a very high incidence. Despite the great promise of cell therapy for the treatment of OA, which involves injecting potent cells to differentiate directly into cartilage, the currently available methods pose several limitations, such as the loss of transplanted cells and low chondrogenic differentiation efficacy. Various gene therapy strategies using gene delivery vectors such as virus, nanoparticle are applied to treatment of OA due to these limitations. Among these delivery vectors, adeno-associated virus (AAV) vector is in the spotlight in many gene therapy applications due to its advantages, such as high efficiency and safety. In this study, we aimed to develop AAV-based gene therapy approaches that can promote osteochondral regeneration. Many AAV serotypes have been identified with different tissue tropisms, which is probably determined by cell surface receptors. Thus, we produced the AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 viruses carrying a GFP reporter gene and then compared their infectivity in human chondrocyte cells and other cell types. It was demonstrated that the wildtype AAV showed moderate transduction efficiency in those cells, it would not be sufficient enough to achieve selective and effective gene delivery to target tissues. Therefore, we developed a AAV8 peptide library by utilizing the directed evolution techniques for capsid engineering. We intend to prepare an AAV drug delivery tool that can maximize the transduction efficiency to cartilage cells, which are desired target organs.