Development of engineered ionizable lipid nanoparticles (LNPs) to overcome limitations of in vivo delivery of RNA therapeutics

Abstract

RNA therapeutics have emerged as a promising new class of drugs for treating incurable diseases and genetic disorders by directly targeting and regulating disease-related gene expression. However, effective delivery of RNA therapeutics to target cells is challenging due to their physicochemical properties. To overcome the limitations, lipid nanoparticles (LNPs) have been developed as a delivery system. LNPs effectively encapsulate RNA molecules and protect them from degradation, enabling them to enter cells and perform their therapeutic functions. LNPs have demonstrated enormous potential as in vivo delivery platforms for RNA therapeutics, such as small interfering RNAs (siRNAs), antisense oligonucleotides (ASOs), mRNAs and CRISPR system. Notably, the recent success of COVID-19 mRNA vaccines during the 2019 pandemic has highlighted the potential of RNA therapies. While LNPs hold great promise as a delivery system for RNA therapeutics, several challenges remain and must be addressed. One is the achieving tissue and cell-specific delivery of RNA therapeutics, and another is improving the safety of LNPs for therapeutic use because of their toxicity and immunogenicity. These challenges must be addressed to expand the use of RNA therapeutics for various diseases in future applications. In this thesis, we developed engineered LNPs to overcome the current limitations of LNPs and demonstrate the potential of RNA therapeutics. In Chapter 1, we addressed the challenge of targeted delivery of LNPs. First, we developed LNPs that facilitate delivery to the liver and targeted specific liver cell through passive and active targeting strategies. Then, we incorporated permanently charged lipids to optimize LNPs for extrahepatic delivery and confirmed lung-targeted delivery. Lastly, we optimized LNPs for pulmonary delivery of RNA therapeutics via local delivery and investigated their efficiency and therapeutic effects in disease state. In Chapter 2, we introduced biodegradable LNPs with improved safety. We synthesized biodegradable ionizable lipid candidates based on ester link incorporated lipid tail and selected the most effective candidates. The developed LNPs demonstrated remarkable delivery efficacy of RNA therapeutics, showing significant expression (mRNA) and knockdown (siRNA) of target protein compared to conventional LNPs, while exhibiting lower toxicity and immunogenicity. This efficacy was also demonstrated by delivering siGTSE1 to a liver fibrosis model, effectively alleviating liver fibrosis and restoring hepatocyte homeostasis. Finally, to expand the applications of the biodegradable LNPs, selective delivery to extrahepatic organs after systemic administration was evaluated. As a result, our LNPs demonstrated excellent lung cell targeting and therapeutic potential for chronic lung diseases. In conclusion, our research has demonstrated that LNPs can overcome current limitations, thereby expanding the applicability of RNA therapeutics to various diseases originating from different tissues.;RNA 치료제는 난치성 질환 및 유전 질환 치료를 위한 유망한 치료법으로 많은 관심을 받고 있다. 이는 질병 관련 유전자 발현을 직접적으로 표적하고 조절함으로써 작용한다. 그러나 RNA 치료제를 세포 내부로 효과적으로 전달하는 것은 그들의 물리화학적 특성으로 인해 어려운 과제이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 지질나노입자 (LNPs)가 RNA 치료제 전달에 효율적인 전달 시스템으로 개발되었다. LNPs는 RNA 분자를 효과적으로 캡슐화하고 체내 분해로부터 보호하여 세포 내부로 들어가 치료 기능을 수행할 수 있도록 하며, 작은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASOs), mRNA 및 CRISPR 시스템과 같은 다양한 RNA 치료제의 체내 전달 플랫폼으로서 작용할 수 있다. 특히, 최근 COVID-19 mRNA 백신의 성공은 RNA 치료제의 잠재력을 보여주며, 전달체인 LNPs의 중요성도 강조된다. 하지만 RNA 치료제의 핵심 전달 시스템으로서 LNPs는 아직 해결해야 할 여러 과제가 남아있다. 그 중 하나는 RNA 치료제의 조직 및 세포 특이적 전달을 달성하는 것이고, 또 다른 하나는 그들의 독성과 면역원성을 감소시켜 치료용 LNPs의 안전성을 향상시키는 것이다. 이러한 도전 과제들은 향후 다양한 질환에 대한 RNA 치료법의 사용을 확대하기 위해 해결되어야 한다. 본 논문에서는 LNPs의 현재 한계를 극복하고 RNA 치료법의 잠재력을 입증하기 위해 엔지니어링된 LNPs를 개발하였다. 제 1 장에서는 새롭게 합성된 이온화지질로 구성된 LNPs를 소개하고 수동 및 능동적 표적 전략을 통해 특정 간 세포로 전달하였다. 그런 다음 영구적으로 전하를 띠는 지질을 함께 전달하여 LNPs의 간 외 전달을 확인하였다. 마지막으로, 우리는 RNA 치료제의 폐내 주입을 위한 LNPs를 최적화하고 질병 상태에서의 전달 및 치료 효과를 확인하였다. 제 2 장에서는 개선된 안전성을 가진 생분해성 LNPs를 소개하였다. 우리는 에스테르 결합이 포함된 지질 꼬리를 기반으로 생분해성 이온화지질 후보를 합성하고 스크리닝을 통해 가장 강력한 후보를 선택하였다. 합성된 생분해성 LNPs는 상업적으로 널리 사용되는 LNPs 대비 훨씬 낮은 독성과 면역원성을 보이며, 뛰어난 수준의 단백질의 발현 (mRNA) 및 억제 (siRNA)을 나타냈다. 또한, GTSE1 표적 siRNA 전달을 통해 간 섬유증을 효과적으로 완화하고 간세포의 항상성 회복을 확인함으로써 뛰어난 치료제 전달 효능을 보여주었다. 마지막으로, 정맥 주사 이후 LNPs의 폐 전달이 가능함을 확인하였고, 질병 상태에서도 폐세포를 표적으로 할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 우리의 새로운 생분해성 LNPs가 간 및 간 외 기관의 만성 질환을 치료하기 위한 뛰어난 잠재력을 가지고 있음을 확인하였다. 결론적으로, 우리의 연구는 LNPs가 현재의 한계를 극복하여 다양한 조직에서 발생하는 질병에 대해 안전하고 효과적으로 RNA 치료제를 적용할 수 있는 가능성을 입증하였다.