AKT activation by PtdIns(3,4)P2-mediated mTORC2 recruitment into the early endosome

Abstract

The Serine/Threonine kinase AKT is a major effector during cell signal transduction in response to extracellular stimuli. AKT plays central roles in regulating cell physiological processes such as survival, growth and metabolism. AKT is hyperactivated in metabolic diseases and cancer. Therefore, it is necessary to find therapeutic targets of AKT signaling. Although the phosphoinositide-dependent kinase (PDK1)-mediated AKT phosphorylation at Thr308 has been well studied, the mTORC2 mechanism leading to AKT phosphorylation at Ser473 still remains elusive. To investigate the upstream regulation of mTORC2 in cells, I examined the intracellular dynamics of mTORC2 using mammalian stress-activated map kinase-interacting (mSIN) which is necessary for the assembly of mTORC2, through confocal imaging and biochemical approaches. I revealed that mTORC2 components are localized in the early endosome containing fluorescent EGFs endocytosed and Rab5 positive endosomes. Furthermore, Super-resolution imaging showed the indirect interaction between mSIN and constitutively active Rab5 (Rab5-Q79L). Biochemical experiment also demonstrated that GST-EEA1-Rab5BD (Rab5-GTP binding domain) bound-endosomes interacts with the mSIN and Rictor, not Raptor known as a mTORC1 component. For mediator to recruit mTORC2 into the early endosome, I observed partial colocalization of mSIN-RBD-PH domain with AKT-PH domain (a sensor for PtdIns(3,4,5)P3 and PtdIns(3,4)P2) inside the plasma membrane. This result provides the possibility that mSIN-RBD-PH is involved in PtdIns(3,4)P2 in the early endosome. To confirm the association of mSIN with early endosomal PtdIns(3,4)P2, I observed the colocalization of mSIN with PtdIns(3,4)P2 in Rab5 positive endosomes via specific antibodies. Furthermore, using inducible endosomal targeting lipid phosphatases, I found that PtdIns(3,4)P2 dependent-mTORC2 recruitment controls AKT phosphorylation at Ser473 on the early endosome, but not at Thr308. Likewise, the association of mTORC2 with early endosomes is responsible for local activation of AKT, which is critical for specific signaling transduction through AKT effector including GSK3β. In conclusion, I found that AKT activation by mTORC2 in the early endosome is critical for growth factor receptor-mediated signal propagation and PtdIns(3,4)P2 molecules control the recruitment of mTORC2 leading to AKT activation , especially Ser473-related activation, in the early endosome. ;AKT는 세포가 생존하고 증식하며 물질대사를 하기 위해 매우 중요한 카이네이즈 (kinase)의 일종으로서, AKT 신호전달 체계는 다양한 종류의 하위인자들과 복잡하게 연결되어 있다. 이것이 세포 내에서 제대로 조절되지 못한다면 비만, 당뇨와 같은 대사성 질병이나 더 나아가 암까지도 발병할 수 있다고 알려져 있다. 실제로 많은 암에서 AKT의 발현이 높은 것을 볼 수 있다. 그렇기 때문에 아직까지도 그 조절기전을 밝히려고 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 AKT를 조절 할 수 있는 상위 조절자에는 대표적으로 PDK1과 mTORC2가 알려져 있다. 이들은 AKT의 Thr308과 Ser473을 각각 인산화시키고, AKT가 완전히 활성화 될 수 있도록 역할을 한다. 활성화되는 경로를 더 자세히 살펴보면, 세포 내에 성장인자나 인슐린 같은 자극이 오게 되면 PI3K의 활성이 오르게 되고 이것은 세포 막에 있는 PtdIns(4,5)P2를 PtdIns(3,4,5)P3로 바꿔버린다. 이렇게 생성된 PtdIns(3,4,5)P3에 PDK1과 AKT가 PH도메인을 통해 결합할 수 있고, 이때에 PDK1은 근접해 있는 AKT의 Thr308을 인산화 시킨다. 또한PI3K가 활성화될 때 mTORC2가 활성화 된다고 알려져 있지만, PDK1처럼 어디서 어떻게 결합을 해서 활성화 되는지는 아직까지 확실히 밝혀지진 않았다. 그렇기 때문에 mTORC2의 상위 조절인자에 대해 많은 연구가 진행 중에 있다. 이전의 논문들에서 mTORC2는 Ribosome, MAM, Plasma membrane등에 존재해 AKT의 Ser473을 특이적으로 인산화하고 그에 따른 하위인자가 특이적으로 조절된다고 말하고는 있지만 아직까지 확실한 기전에 대해서는 논의 중이다. 이 논문에서는 mTORC2-AKT의 상위 조절자에 대해 공초점 현미경 (confocal)을 통한 이미지와 생화학적 실험을 통해 연구를 진행하였다. 세포에 자극이 주어질 때 mTORC2의 중요 구성물들이 초기 엔도좀 (Early endosome)으로 모이게 되는 것을 이미지와 분리 실험 (fractionation)을 통해 증명해 내었다. 그뿐만 아니라 자극에 따른mTORC2가 초기 엔도좀으로 가기 위해서는 PtdIns(3,4)P2가 중요한 역할을 한다는 것을 알아내었다. 더 나아가 일시적으로 엔도좀으로 가는 포스파테이즈 (phosphatase)를 이용하여, mTORC2가 초기 엔도좀에서AKT의 Ser473을 인산화 시키는데 PtdIns(3,4)P2가 중요한 장소를 제공해주는 역할을 한다는 것을 밝혀내었다. 이러한 특정한 장소에서의 AKT의 활성은 GSK3β와 같은 AKT의 하위 인자를 특이적으로 조절 하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 그러므로 초기 엔도좀에서 mTORC2가 매개하는 AKT의 활성은 수용체(receptor)가 매개하는 신호를 증폭시키는 데에 중요한 역할을 할 수 있고, 이때 PtdIns(3,4)P2가 초기 엔도좀으로 mTORC2가 오게 하는데 관여한다고 말을 해준다. 이러한 연구는 국소적인 AKT의 활성을 조절해서 AKT와 관련된 질병을 치료할 수 있는 데에 도움을 줄 수 있을 것이라고 기대한다.