Engineering of the Baeyer-Villiger monooxygenase-based Escherichia coli biocatalysts for the oleic acid biotransformation into 9-(nonanoyloxy)nonanoic acid

Abstract

Renewable oils and fatty acids are one of the most important feedstock. Thereby, the biotransformation of oleic acid into 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid, which can be transformed into industrially relevant C9 chemicals (e.g., 9-hydroxynonoic acid and n-nonanoic acid), was investigated. The catalytic efficiency of the Baeyer-Villiger monooxygenase of Pseudomonas putida KT2440 (Pp-BVMO), which is involved in C-C bond cleavage of the long chain fatty acids and considered as a rate-limiting enzyme, was improved via substrate access tunnel engineering. The CAVER analysis suggested that S397 and L255 are located nearby bottle neck of the substrate access tunnel. Thus, the S397A and L255A mutations were conducted by using Pp-BVMO_C302L/M340L/M380L as a template. Notably, the catalytic efficiency of quintuple mutant (i.e., Pp-BVMO_C302L/M340L/M380L/S397A/L255A) reached 81 mM-1 s-1, which is 2.8-fold greater than that of the triple mutant. Moreover, application of the solvent tolerant Escherichia coli (E. coli) MG1655 strain expressing a fatty acid double-bond hydratase from Stenotrophomonas maltophilia and a secondary alcohol dehydrogenase from Micrococcus luteus in addition to the engineered Pp-BVMO led to production of 45mM of 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid from 50 mM oleic acid. Furthermore, deletion of arcA by using CRISPR-Cas9 allowed E. coli MG1655 to less produce the toxic metabolite acetic acid during biotransformations. These results will contribute to production of the industrially relevant C9 chemicals from renewable fatty acids. ;Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs)는 NADPH와 산소를 이용해 케톤 유도체를 에스터로 전환하는 생촉매입니다. Pseudomonas putida KT2440 유래 (Pp-BVMO)는 올레산으로부터 바이오 플라스틱 단량체 생산에 이용되는 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid를 생산하는 다단계 반응 중에서 핵심 효소입니다. 그러나, BVMO는 반응 시 퍼옥시플라빈을 형성해 과산화수소를 만들 수 있어 안정성과 활성이 낮습니다. 따라서, 이전 연구에서 확립한 Pp-BVMO 변이체와 그 구조를 바탕으로 in-silico 분석을 통한 tunnel engineering을 진행했습니다. 결과적으로, 기존에 비해 더 높은 촉매 활성 (81s-1·mM-1)을 가진 변이체 (Pp-BVMO_ C302L/M340L/M380L/S397A/L255A) 구축에 성공했습니다. 이후 내성이 높은 Escherichia coli K-12 균주에 개량된 BVMO 변이체와 올레산 수화효소, 장쇄지방산 수송체, 알코올 탈수소효소를 함께 발현시켰습니다. 이 과정에서 배양 및 생물전환 최적화를 위해 글리세롤이 포함된 새로운 배지를 만들었습니다. 그 결과 E. coli MG1655는 90%의 높은 수율로 9-(nonanoyloxy) nonanoic acid 45mM을 생산했습니다. 또한, 반응 중 축적되는 아세트산 문제를 해결하기 위해 CRISPR-Cas9을 이용해 조절 유전자 arcA를 삭제했습니다. 대사회로 재설계를 통해, 아세트산 축적양을 7배, 글리세롤 사용량을 20% 줄이면서 경제적 균주를 성공적으로 개발했습니다. 이러한 생물전환 기반 고부가가치 중쇄 지방산 생성 연구는 친환경의 선순환에 기여할 것입니다.