Chemically Modified Substrate RNA for RNAi Mediated Gene Therapy

Abstract

핵산 물질을 치료제 형태로 개발한 유전자 치료제는 뉴클레오타이드 서열의 변화만으로 모든 유전자의 발현을 조절할 수 있어 기존 약물로 치료하기 어려운 질환들에 대항할 수 있는 차세대 신약 기술로서 활발하게 연구되고 있다. 세포 내 존재하는 유전자 발현 조절 기전들을 유전자 치료제에 적용하기 위한 다양한 접근법이 시도되고 있다. 현재 임상 개발 중에 있는 유전자 치료제 예로는 유전자 침묵(Gene silencing) 과정을 통해 목적 유전자의 mRNA 분해를 유도하는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 표적 서열에 상보적으로 결합하여 스플라이싱(Splicing)을 조절하거나 miRNA의 작용을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 그리고 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 유사한 기능을 가진 압타머(Aptamer)가 있다. 세포 내 유전자 침묵 기전에 관여하는 다이서(Dicer) 단백질의 기질로서 작용하는 다이서 기질 siRNA 는 기존의 siRNA보다 더욱 강화된 유전자 침묵 활성을 보임을 확인하였다. 또한 생체 내 핵산분해효소에 의한 분해에 취약하며 면역원성으로 인식되는 핵산 물질 자체의 특성을 극복하기 위해 핵산 구조의 화학적 변형을 도입하여 유전자 치료제의 안정성을 증가시키는 방법이 개발되었다. 핵산 물질은 선행적으로 디자인한 뉴클레오타이드 서열의 상보적 결합을 이용해 정밀한 구조물을 쉽게 형성할 수 있다. 단일 가닥 핵산 물질들은 자기 조립(Self-assembly)을 통해 핵산 나노 구조체를 형성할 수 있으며 핵산 나노 구조체 내부에 다양한 유전자 치료제를 보유함으로써 단일 입자만으로 다양한 생물학적 활성을 발현할 수 있다. 3 가닥의 단일 가닥 RNA를 자기조립 하여 제작한 Y-형태의 RNA 나노 구조체를 다이서 기질 siRNA로서 작용할 수 있으며 기존 siRNA보다 우월한 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있다. 1장에서는 Y-RNA를 임상에 적용할 수 있는 핵산 치료제로서 개발하기 위한 과정에 대하여 다루었다. Y-RNA의 미세한 구조적 혹은 화학적 변형으로도 Y-RNA의 유전자 침묵 활성은 크게 달라질 수 있었다. 이러한 차이점은 구조적 혹은 화학적 변형이 다이서와 Y-RNA 상호작용을 저해하여 다이서 가공 과정을 저해하기 때문임을 확인하였다. 자연적으로 존재하는 RNA 구조를 활용하여 만든 핵산 나노 구조체는 세포 내 단백질과 상호작용 할 수 있어 인공적으로 만든 핵산 나노 구조체보다 더 효율적인 유전자 조절이 가능하다. 드로샤(Drosha)는 세포 내 유전자 침묵 과정에서 다이서의 상위 단계에 작용하는 단백질로 DGCR8라 하는 단백질과 복합체를 형성한다. 드로샤/DGCR8 복합체는 핵 내에서 전사된 pri-miRNA의 이중 가닥 부위(Stem)를 절단하고 절단 산물 중 상부 헤어핀 구조는 세포질로 방출된다. 2장에서는 새로운 단백질 기질 RNA인 pri-miRNA를 새로운 유전자 치료제 플랫폼으로 개발하는 과정에 대하여 다룬다. 헤어핀 RNA 구조에 Drosha/DGCR8 복합체의 기질로서 인식되기 위한 필수적인 요소들을 포함시켜 artificial pri-miRNA를 제작하였다. 이중 가닥 부위에 siRNA 서열을 도입한 artificial pri-miRNA는 세포 내 RNAi 경로에 의한 유전자 침묵 효과를 나타내었다. 또한 artificial pri-miRNA에 다이서와 드로샤가 상호작용 하지 않는 부위만을 선택적으로 2’-OMe 변형을 도입하였을 경우 유전자 침묵 활성을 유지하면서 안정성을 향상시킬 수 있었다. Artificial pri-miRNA에서 유전자 침묵에 관여하는 이중 가닥 부위를 제외한 5’ 말단과 3’ 말단의 하단 단일 가닥과 상단 단일 루프 구조 단일 가닥은 드로샤 가공 과정과 다이서 가공 과정을 거치며 전체 핵산 구조로부터 분리된다. Artificial pri-miRNA의 유전자 침묵 과정에 관여하지 않는 부위에 유전자 치료제를 추가로 도입하여 다기능성 핵산 구조체를 제작할 수 있다. 하단 단일 가닥 부위에 ASO 서열을 도입한 결과 스템 부위의 유전자 침묵을 유도함과 동시에 ASO로서의 기능인 스플라이싱 조절 혹은 miRNA 저해 효과를 나타내었다. 본 논문을 통해 새로운 핵산 기질 나노구조체인 artificial pri-miRNA는 여러 가지 핵산 치료제를 동시에 도입함으로서 치료 효과의 시너지를 제공할 수 있으며 유전자 치료 응용 분야에서 광범위하게 활용될 가능성을 보였다.;Nucleic acid therapeutics have shown great promise in the field of gene therapy due to their versatile nature in broadening drug targets. They can be used to regulate the expression of target genes that are difficult to control with conventional therapies. Various gene regulation mechanisms have been applied to different types of nucleic acid therapeutics, and several of these approaches are currently under clinical development.: Short interfering RNA (siRNA) is one such approach that induces mRNA degradation by silencing genes with sequence specific manner. Antisense oligonucleotides (ASOs) bind to a target sequence complementarily and regulate splicing or inhibit the action of micro RNAs (miRNAs). Aptamers are another type of oligonucleotide that exhibit antibody-like activity and can bind to a specific substance. Additionaly , siRNAs that are longer than 21 bp act as substrates for the Dicer protein, that is involved in intracellular gene silencing mechanisms and can enhance gene silencing activity. Moreover, chemical modification of oligonucleotides has been investigated to overcome their susceptibility to degradation and immunogenic properties. Single-stranded oligonucleotides can self-assemble to produce nucleic acid nanostructures with precise designs through complementary nucleotide binding. These nanostructures can possess numerous therapeutic activities as they contain multiple nucleic acid therapeutics in a single molecule. Y-RNA, that is produced through the self-assembly of single-stranded RNAs, functions as a Dicer substrate RNA and demonstrates improved gene silencing capabilities compared to conventional siRNA. Chapter 1 details the creation of Y-RNA as a nucleic acid therapeutic agent that is capable of multiple and simultaneous gene regulation. Changes in chemical modification patterns of Y-RNA led to significant differences in gene-silencing activity. These modifications, whether structural or chemical, can interfere the interaction of Dicer with Y-RNA, thereby inhibiting Dicer processing of Y-RNA. RNA nanostructures can be prepared using natural long-noncoding RNA as a framework, that can recruit regulatory proteins to enable efficient gene regulation. The RNA interference pathway is initiated by the transcription of primary-microRNA (pri-miRNA), that contains long single-stranded RNAs at its 3’ and 5’ ends. The double-stranded region (stem) of pri-miRNAs is cleaved by the Drosha and DGCR8 protein complex, and the resulting hairpin RNA is released into the cytoplasm for gene silencing. Chapter 2 details the development of pri-miRNAs as a new gene therapy platform, in which an artificial pri-miRNA was designed to include key features for recognition as a substrate RNA of the Drosha/DGCR8 complex in the hairpin RNA structure. When RNA interference (RNAi) sequence was incorporated into the stem region of the artificial pri-miRNAs, they exhibited target-specific gene silencing effects mediated by endogengous microRNA biogenesis. Furthermore, chemical modification of the artificial pri-miRNA structure based on RNA-protein interactions improved its stability without disrupting its gene silencing activity. The 5’ and 3’ termini, as well as the apical loop, of the artificial pri-miRNA do not participate in gene silencing and are separated from the rest of the nucleic acid structure through Drosha and Dicer processing. These regions can be used for other purposes. By incorporating antisense oligonucleotide (ASO) into the basal single-stranded region, the artificial pri-miRNA exhibited effective modulation of splicing and inhibition of miRNA, in addition to targeted gene silencing. The use of artificial pri-miRNAs can result in synergistic therapeutic effects by simultaneously introducing various types of nucleic acid therapeutics. Our research highlights the potential of artificial pri-miRNAs for widespread applications in gene therapy.