High Sensitive and Selective Quantification Method of Linear Fatty Acids Using Paired Ion Electrospray Ionization Mass Spectrometry Coupled with Capillary Electrophoresis

Abstract

The analysis method of this study using ion pairing reagents contributed to development of a sensitive and selective capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS) technique for determination of linear fatty acids. CE separation of 21 FAs was optimized through comparison on concentration of ammonium formate buffer as a separation electrolyte, types of organic modifiers and proportion of organic modifier. The 21 FAs were separated by using the optimized method condition at pH10 in negative ion electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS). It provided appropriate separation efficiency, but acetic acid (C2:0) and propionic acid (C3:0) were not detected even at 100 μg/mL, because of low sensitivity. In order to resolve the problem, ion-paired reagents (IPR) were used by the experiment for enhancing sensitivity. The dicationic ion pairing reagents formed singly charged complexes with anionic fatty acids. It was conducted in three different ways, pre-column, on-column and post-column, depending on where the IPR was applied. One out of the three ways tested, post-column mode, which was continuously infused with IPR through a sheath-liquid into ionization source during the CE separation of FAs in positive ion ESI-MS, was the best method. Among the four type of IPRs tested, 1,5-pentanediyl-bis(1-butylpyrrolidinium)difluoride (C5(bpyr)2) was the best IPR for improvement of detection sensitivity and it formed charged FAs complexes to be detected in positive ion mode. By using the optimized condition of the IPR, a good linearity (R2 > 0.99) of calibration curves was obtained for 15 FAs (C2:0~C16:0) ranging from 0.5 to 150 μg/mL. Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were ranged from 0.13 to 2.88 μg/mL and from 0.44 to 9.62 μg/mL, respectively. The RSD (%) values by the intra-day (n=5) and inter-day (n=5) experiments were between 0.94 and 7.90 at 10 μg/mL, respectively. The results of this paired-ion electrospray ionization (PIESI) technique was remarkable when compared to the negative ion ESI detection result without using IPR, because the effect for the detection was significantly improved in short-chain fatty acids (SCFAs) and medium-chain fatty acids (MCFAs). Quantitative analysis using the optimized method has been employed to determine FAs in cheese and coffee as real samples. 10 FAs (C2: 0, C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C12:0, C13:0, C14:0, C15:0 and C16:0) were contained in the cheese and other remaining fatty acids were below the detection limit. Also, in the coffee, 6 FAs (C2:0, C3:0, C4:0, C5:0, C6:0 and C16:0) were confirmed by the developed method. The quantitative recovery (%) were between 74.1 and 108.2.;이온 쌍 시약 (IPR) 을 이용한 이 연구의 분석 방법은 선형 지방산 (FAs) 의 결정을 위한 민감하고 선택적인 모세관 전기 영동 질량 분광계 (CE-MS) 기술의 발전에 기여했다. 첫 번째로, 완충액의 포름산 암모늄 농도, 완충액의 유기 용매 종류 및 농도를 비교하여 21 개 FA의 CE 분리를 최적화했다. 21 개의 음이온 FAs 은 전기 분무 이온화 - 질량 분석 (ESI-MS)을 이용해 pH10에서 최적화 된 방법 조건을 사용하여 분리되었다. 최적화된 그 방법은 분리 효율 면에서 좋았지만 아세트산 (C2 : 0)과 프로피온산 (C3 : 0)이 100mg / mL에서도 검출되지 않았다. 그리고 특히 단 쇄 지방산에서 지방산의 검출 감도가 낮았다. 이러한 이유 때문에, 감도를 높이기 위해 이온 쌍 시약 (IPR)을 실험에 사용했다. 이 dicationic 이온 쌍 시약 (IPR)은 pH 10 완충액에서 2가 양이온으로 이온화 되기 때문에 1가 음이온 성 화합물과의 1가의 양이온 착 화합물로 존재한다. IPR이 적용된 위치에 따라, 프리 –, 온 – 및 포스트 – 컬럼 (post-column) 의 3 가지 방식으로 수행되었다. 시험 된 3 가지 방법 중, 포스트 칼럼 (post-column) 모드가 최상의 방법이었다. 이 방법은 (+) ESI-MS mode 에서IPR이 이온화 소스 (ESI source)에서 시스 – 액체 (sheath-liquid) 를 통해 FA의 CE 분리 동안 지속적으로 계속 주입되는 방법이다. 4가지 IPR을 보조 – 액체 (sheath-liquid) 를 통해 주입한다. 그 중에 1,5-pentanediyl-bis(1-butylpyrrolidinium)difluoride (IPR1, C5(bpyr)2) 가 검출 감도를 가장 많이 향상시키고 FAs와 IPR 의 화합물을 1가 양이온으로 형성하기 위한 최상의 IPR이었다. IPR의 최적화 된 조건을 사용하여 0.5 ~ 150 μg / mL 범위의 15 가지 FA (C2: 0 ~ C16: 0)에 대해 우수한 선 형성 (linearity) (R2> 0.99)이 얻어졌다. 검출 한계 (LOD)와 정량화 (LOQ)는 각각 0.13 ~ 2.88 μg / mL 및 0.44 ~ 9.62 μg / mL 범위였다. intra-day (n = 5)와 inter-day (n = 5) 실험에 의한 RSD (%) 값은 10 μg / mL에서 0.94와 7.90 사이였다. 이 쌍 이온 전기 분사 이온화 (PIESI) 기술의 결과는 IPR을 사용하기 전의 음이온 ESI 검출 결과와 비교할 때 주목할 만하다. 왜냐하면 검출 감도 효과가 특히 짧은 사슬 지방산 (SCFAs)과 중간 사슬 지방산 (MCFA)에서 향상되었기 때문이다. 최적화 된 방법을 사용한 정량 분석은 치즈와 커피의 FA를 실제 샘플로 결정하기 위해 사용되었다. 개발된 방법을 이용하여 치즈에서는 10 개의 (C2: 0, C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C12:0, C13:0, C14:0, C15:0 and C16:0) 지방산을, 커피에서는 6 개의 지방산 (C2:0, C3:0, C4:0, C5:0, C6:0 and C16:0) 을 검출하고 정량 분석을 할 수 있었다. 정량적 회수율 (%)은 74.1에서 108.2 사이였다.