Neuroprotective effects of eleutherin against oxidative glutamate toxicity in hippocampal HT22 cells

Abstract

Eleutherin is one of the major naphthopyran components isolated from Cipura paludosa (Iridacea), which have been traditionally well presented by their anti-infectious and anti-tumorigenic effects. However, the CNS effects of elutherins have been less studied. Previously, our laboratory found the eleutherin’s in vitro antiamyloidogenic effect (antioligomerization) and preventive effects on neurotoxicity induced by co-treatment of Aβ+NMDA in mouse hippocampal slice culture. Oxidative stress caused by Aβ toxicity plays a crucial role in the onset and deterioration of Alzheimer's disease (AD). Therefore, many approaches to investigate neuroprotection have been focused on antioxidant systems. The present study generally aimed to assess protective effects of eleutherin against oxidative glutamate toxicity in hippocampal HT22 cells and explore its potential mechanism. Based on our previous result for the protective effects of eleutherins against Aβ toxicity, whether the non-amyloidogenic pathway product, sAPPα, which is known to control neuronal survival, synaptic plasticity and inhibit Aβ formation, could be involved in the neuroprotective effect of eleutherins were examined. Eleutherins stimulated basal sAPPα production in normal HT22 cells, and also significantly increased the sAPPα level reduced by hydrogen peroxide (H2O2) treatment. The glutamate-induced HT22 cell death that has been extensively used as endogenous oxidative stress model was utilized to investigate possible protective mechanisms of eleutherin. Abnormally increased intracellular ROS level induced by glutamate toxicity in HT22 cells was significantly inhibited by eleutherin. Among the many mechanisms that cause glutamate-induced cell death, because change referring mitochondrial damage leading to oxidative stress-mediated neuronal death was significantly recovered by eleutherin, it can be expected that eleutherin would also protect against toxicities induced by interfering with complex I or Ⅲ of the electron transport chain in mitochondria with inhibitors such as rotenone and antimycin-A. Unexpectedly, protective effects of eleutherin against toxicity induced by rotenone, antimycin-A and exogenous H2O2 were much weaker than its effect on toxicity induced by Aβ+NMDA or glutamate-induced toxicity. It was also investigated whether the GSK3β-mTOR signaling-CRMP-2 protein expression that are closely involved in neuronal survival/death as master regulators to control cellular homeostasis are involved in the eleutherin’s neuroprotective effects. Eleutherin restored the glutamate-induced decreased expression and activity of GSK3β to the control level. Eleutherin also significantly recovered the dysregulated mTOR downstream signals, and enhanced the CRMP-2 expression reduced by glutamate. It is not likely that eleutherin directly activates mTOR, because of no inhibitory effect of the mTOR inhibitor, rapamycin, on the eleutherin’s function recovering the glutamate-induced decreases in mTOR signals and CRMP-2. Additional study addressed whether the iron-dependent ferroptotic death mechanism that is distinct from apoptosis, necrosis or autophagy, and leaded by enhanced lipid peroxidation play roles as important mechanisms for the eleutherin’s neuroprotection against glutamate-induced toxicity. Eleutherin completely blocked severe cell death induced by two ferroptosis-inducing agents, erastin and buthionine sulfoxamine (BSO). In addition, the arachidonic acid-induced cell death that was further accelerated by adding low concentrations of glutamate was completely restored by eleutherin. Although eleutherin reduced the glutamate-induced ROS levels and blocked glutamate- or BSO-induced neurotoxicity, eleutherin did not restore the glutathione (GSH) level reduced by glutamate or BSO, suggesting that the protective impact of eleutherin was not mediated by an antioxidant mechanism via restoration of GSH levels. The present study found that eleutherin produces potent preventive effects against glutamate-induced toxicity. An underlying mechanism proposed is that eleutherin increase sAPPα that can protect ferroptotic neuronal death by modulating iron stability. This thesis provided important in vitro evidences for eleutherin’s potential as a preventive or therapeutic agent possibly for AD and many other oxidative toxicity-induced diseases.;Eleutherin은 eleutherine Americana (Iridaceae)에서 추출된 1,4-naphtopyran 부분을 포함한 naphthoquinone 구조의 유도체로써, 항염증과 항암작용을 나타낸다고 알려져 있다. 하지만 중추신경계 시스템에서의 eleutherin의 효과에 대한 연구는 현재까지 뚜렷하게 밝혀진 바가 없다. 우리 연구실의 이전 실험결과, eleutherin은 아밀로이드 베타(amyloid-beta: Aβ)의 응집(oligomerization)을 저해하는 효과를 보였으며, 또한 마우스 기관형 해마 조각배양(mouse hippocampal slice culture)에서 NMDA로 상승된 Aβ독성으로 인한 해마조직의 세포사멸을 유의적으로 막는다는 것을 확인하였다. Aβ독성으로 기인된 산화적 스트레스 (oxidative stress)는 알츠하이머 (Alzheimer’s disease: AD)의 발병 및 악화에 결정적인 역할을 한다. 그러므로 신경퇴화에 대한 신경보호의 많은 접근법이 항산화 시스템에 초점을 맞추고있다. 본 연구에서는, 마우스 해마조직에서 유래한 HT22 세포 시스템에서의 글루탐산(glutamate)으로 유도되는 산화적 스트레스 매개 신경독성에 대한 eleutherin의 방어효과를 평가하고 그 잠재적인 메커니즘을 탐색하여 신경세포의 손상을 예방할 수 있는 약물로의 가능성을 조사하고자 하였다. 먼저, eleutherin이 Aβ와 NMDA독성으로 유도되는 마우스 해마조직의 세포사멸을 억제시키는 이전 실험결과를 바탕으로, 뇌에서 신경흥분성, 시냅스 가소성 및 세포생존을 조절하고 베타절단효소(β-secretase)의 활성을 억제, Aβ 형성을 저해하여 신경손상을 예방한다고 알려져 있는 sAPPα 레벨을 측정하였다. 그 결과, eleutherin은 정상상태의 HT22 세포에서도 sAPPα 생성을 촉진시켰으며, 과산화수소 (H2O2) 처리에 의해 감소된 sAPPα의 레벨을 유의적으로 증가시켰다. 이를 통해 eleutherin이 신경보호 효과를 가질 수 있음을 예측해 보았다. 다음으로, 글루탐산으로 유도되는 HT22 세포사멸을 사용하여 eleutherin이 세포를 보호할 수 있는지 여부와 작용 가능한 메커니즘을 조사하였다. 과도하게 증가된 세포 내 활성산소 수준은 단백질 산화, 지질 과산화, 과도한 소포체 스트레스 (endoplasmic reticulum stress: ER stress) 및 미토콘드리아 기능의 손상을 통해 많은 뇌 질환에서 신경세포 사멸을 일으키는 것으로 잘 알려져 있으며 HT22 세포에서 글루탐산 독성의 주요 기전으로 여겨져 왔다. 이번 연구에서는 글루탐산을 5 mM 또는 10 mM로 처리하여 유도되는 세포독성에서 eleutherin을 한시간 전 처리 함으로써 동일한 보호효과를 나타내는지 여부와 세포 내 활성산소 레벨변화, 소포체 스트레스의 지표 단백질 변화 및 미토콘드리아 기능장애에 영향을 미치는지를 확인하였다. 그 결과, 글루탐산 처리에 의해 세포생존율이 50% 또는 80%까지 떨어진 조건에서 eleutherin은 세포사멸의 심각성과는 상관없이 완벽하게 세포생존율을 유지시켰다. 실험결과에서 흥미로운 것은 eleutherin이 낮은 농도인 1 µM에서 세포 보호효과가 우수하게 나타난 것이다. 또한 과도하게 증가된 활성산소의 레벨도 eleutherin의 전처리로 현저히 줄어든 것을 확인하였다. 실험들을 통해 eleutherin의 뛰어난 세포보호작용을 관찰할 수 있었고 이러한 보호효과가 GSK3β-mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling-CRMP-2 기전과 연관되어 나타날 수 있다고 추측하였다. mTOR signaling은 신경세포의 활성, 단백질 전사 및 합성을 조절하여 세포의 정상적인 형태를 유지하며 세포 항상성을 조절하는 주요 조절자로써 뉴런의 생존 및 사망에 밀접하게 관련 되어 있는 것으로 보고되고 있으며, mTOR signaling의 비정상적인 활성화 및 억제는 많은 뇌질환을 야기한다고 보고되고있다. 따라서 후속 실험에서는 글루탐산을 처리하고 eleutherin을 농도별로 처리하였을 때 mTOR pathway 단백질들 (GSK3β, P70S6k, S6, CRMP-2)의 레벨 변화를 통해 eleutherin이 나타내는 신경보호작용에 대한 주요 메커니즘으로서 역할을 하는지 그 연관성을 조사해 보았다. 글루탐산의 농도에 따라 mTOR signaling은 과도하게 활성화 되거나 반대로 억제되게 된다. P70S6k와 S6의 인산화 정도를 비교한 결과, 글루탐산 5 mM을 처리한 조건에서는 정상의 인산화 레벨보다 더 증가된 것을 확인하였고 이것은 mTOR signaling의 과도한 활성화를 의미한다. 글루탐산 10 mM을 처리한 경우는 극심한 세포독성으로 인해 정상 단백질 수준이 완전히 없어졌다. 반면에, eleutherin을 전처리한 그룹은, 과도하게 활성화된 단백질 레벨은 정상수준으로 낮춰주고 반대로 단백질 발현이 완전히 없어진 것은 정상수준으로 올려 회복시켰다. 이와 같은 결과를 바탕으로 eleutherin이 mTOR pathway에 직접적으로 관여하여 세포보호 작용을 나타내는 것으로 추정하고 직접적인 mTOR 억제제로 알려져 있는 라파마이신 (rapamycin)을 처리하였을 때, eleutherin의 효과를 확인함으로써 mTOR signaling을 조절할 수 있는 약물로써 가능성을 증명하고자 했다. 하지만 예상과 달리, eleutherin은 라파마이신에 의한 세포사멸에는 전혀 효과를 나타내지 못했으며 억제된 mTOR signaling도 회복시키지 못했다. 이 결과들을 통해, eleutherin의 세포보호작용은 mTOR의 상위단계에서 조절되어 나타나거나 또 다른 메커니즘과 연관되어 나타나는 것이라는 결론을 얻을 수 있었다. 추가적으로, 글루탐산 세포독성에 대한 eleutherin이 나타내는 강력한 신경세포 보호작용이 다른 종류의 세포독성물질로 유도된 세포사멸에서도 나타날 수 있는지 범위를 확장하여 관찰해 보았다. 외인적으로 산화스트레스를 증가시킬 수 있는 과산화수소, 미토콘드리아 기능을 손상시켜 활성산소를 증가시키는 미토콘드리아 복합체 억제제, rotenone 또는 antimycin-A로 유도한 세포사멸에서 eleutherin의 효과를 평가하였다. 흥미롭게도 eleutherin은 이들 세가지 독성물질에 대한 세포사멸은 글루탐산-유도 세포사멸을 막는 보호효과보다 현저하게 떨어지는 것을 관찰하였다. 따라서 eleutherin의 효과가 굉장히 특이적으로 작용하여 나타날 수 있다는 것을 생각 할 수 있었다. 최근 연구에서 철 대사와 아밀로이드전구체 단백질 (amyloid precursor protein: APP) 사이의 밀접한 관련성을 보고하였는데, 이번 결과에서 언급된 eleutherin의 sAPPα 촉진효과는 철 이온의 안정화 또는 대사를 조절하여 산화적 스트레스 및 신경손상을 예방할 또 다른 기전으로 간주 될 수 있다고 가정했다. 따라서 철 의존성 세포사멸 메커니즘인 ferroptosis에 주목하여 eleutherin의 작용기전을 살펴보았다. Ferroptosis 유도물질로 알려진 erastin 또는 buthionine sulfoximine (BSO)를 HT22 세포에 처리한 결과, 세포생존율이 20% 이하로 심각한 손상을 주었다. 이러한 조건에서 eleutherin의 전처리는 놀랍게도 글루탐산에 대한 강력한 보호작용과 마찬가지로 거의 완벽하게 세포사멸을 차단하는 효과를 보였다. Ferroptosis로 유도되는 심각한 세포사멸이 글루타치온의 결핍으로 인한 항산화기전의 억제로 나타난다는 연구를 바탕으로, eleutherin이 세포내에 글루타치온 농도를 높은 수준으로 유지시키는지 측정하였는데, 기대와 달리, eleutherin은 글루타치온 레벨을 높이지 못했다. 결론적으로, eleutherin이 강력하게 ferroptosis를 차단하는 효과는 글루타치온 농도와는 관련성이 없다고 판단할 수 있다. 마지막으로, ferroptosis는 지방의 과산화를 유도하여 세포내 활성산소의 작용을 촉진한다. 이번 실험에서는 지방 과산화를 유도하는 아라키돈산을 처리하였고 이 물질은 저농도의 글루탐산 (2 mM)의 독성을 더욱 상승시켰다. 그 결과, 80%이상 세포사멸이 일어났고 eleutherin의 전처리는 앞선 결과들과 마찬가지로 세포생존율을 정상수준으로 회복시켰다. 모든 결과를 종합해볼 때, 글루탐산으로 유도된 세포 독성에서eleutherin의 강력한 보호작용을 확인할 수 있으며, 그 작용기전으로는 철에 의존하는 세포사멸 기전에서 eleutherin이 세포 내 sAPPα 레벨을 증가시킴으로써 나타나는 것이라고 추정할 수 있다. 따라서 eleutherin의 ferroptosis-세포사멸 방어효과에 대한 정확한 표적 메커니즘을 추가로 조사할 필요가 있다. 이 연구는 eleutherin이 알츠하이머 및 기타 여러가지 산화독성 유발 질환의 예방 또는 치료 후보약물로써 평가된다는 중요한 in vitro 증거들을 제시하였다.