Characterization of Two Molecular Targets

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative movement disorder which is characterized by the selective loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc). PD prevalence increases dramatically as the number of older people increases worldwide. However, there is no effective neuroprotective therapy to delay disease progression other than limited symptomatic treatments. Thus, it is imperative to establish novel therapeutic targets to stop or delay DA neuronal loss. Although the exact mechanism(s) underlying DA neuronal loss remains elusive, oxidative stress (OS) (or reactive oxygen species) has been regarded to play a pathological role in the selective loss of DA neurons in PD. Previous studies including ours strongly suggest that OS not only inflicts direct cellular damages, but also disturbs vital cellular signaling pathways including autophagy and programmed cell death (PCD). However, a number of clinical studies of antioxidants therapy for the treatment of PD turned out to be not effective in prevention of DA neuronal loss. Therefore, I hypothesized that manipulation of both the OS-induced altered autophagy and the direct therapeutic intervention of OS-induced PCD will be a better strategy to save DA neurons degeneration. To address this objective, a series of following experiments were carried out. First, I chose and characterized Tnfaip8/Oxi-α as a potential therapeutic intervention target to restore the OS-induced altered autophagy by elucidation of the molecular mechanism underlying autophagic inhibition by Oxi-α. Previously the Oxi-gene family was identified in DA neurons as novel autophagy regulators modulated by OS. Specifically, OS decreased the expression of Oxi-α and increased the expression of Oxi-β, which exerted the opposing effects towards autophagy via regulation of mTOR phosphorylation. However, the mechanism underlying anti-autophagic action of Oxi-α remains yet to be elucidated. To uncover the anti-autophagic mechanism of Oxi-α, I employed the novel insulin-induced Oxi-α model in hepatic cells, because autophagy is inhibited via the induction of Oxi-α by insulin in hepatocytes. I have discovered that insulin temporally induces Oxi-α, which mediates the anti-autophagic action of insulin through formation of a novel ternary complex including Oxi-α, phosphatidylethanolamine (PE) and Gαi3. Specifically, an X-ray crystallographic study of Oxi-α from Mus musculus at 2.03 Å together with liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analyses reveal PE in the hydrophobic cavity. However, an Oxi-α mutant lacking PE does not interact with Gαi3, indicating that the PE component is critical for the anti-autophagic action of Oxi-α via interaction with Gαi3. Furthermore, the localization study of Oxi-α suggested that Oxi-α may interact with Gαi3 at the plasma membrane when insulin signal gets activated. Therefore, the Oxi-α - PE complex acts as an essential upstream effector via the ternary complex formation with Gαi3 during insulin-induced anti-autophagy. The present structural and functional characterization of the upstream effector complex may help identify a novel pharmacological target to counteract the altered autophagy induced by OS in PD. This may also help counteract the defective hepatic autophagy which induces insulin resistance observed in obesity and diabetes. Second, I characterized whether caspase-3-dependent mechanism can serve as a strategy to regulate OS-mediated DA neuronal death. Here, I demonstrated that the genetic intervention of caspase-3 prevented OS-induced cell loss, whereas it induced severe mitochondrial dysfunction. Specifically, the caspase-3-deficient DA neuronal cells were highly resistant to OS-induced cell death, although the initiator caspase-9 was still activated. The detailed phenotypic characterization of the caspase-3-deficient DA cells revealed the severe mitochondrial dysfunction, such as accumulation of damaged mitochondria with characteristic swollen structure and broken cristae, reduced membrane potential, increased oxidative stress and mitochondrial OXPHOS enzyme deficits. Of great interest, the mitochondrial biogenesis was dramatically decreased in caspase-3-deficient DA cells, whereas their mitophagic capability was normal. In accordance with this observation, the caspase-3 gene knock down (KD) resulted in dramatically decreased expression of the key transcriptional activators of mitochondrial biogenesis, such as Tfam and Nrf-1, implying the non-apoptotic role of procaspase-3 in mitochondrial biogenesis. Therefore, the anti-apoptotic intervention by targeting caspase-3 should be considered with caution because of its potential adverse effect on mitochondria dynamics. This finding also suggests a novel functional role of procaspase-3 in the mitochondrial biogenesis. Taken together, the results of the present study suggest that the specific modulation of altered autophagy by targeting of Oxi-α - PE - Gαi3 complex formation and the direct intervention of PCD by inhibition of caspase-3 might afford protective effects against OS-induced cell death. In particular, Oxi-α may be used as a better autophagy regulator in conjunction with Tnfaip1/Oxi-β in restoration of altered autophagy in PD and the hepatic insulin resistance. Additionally, genetic and/or long-term pharmacological interventions targeting caspase-3 may result in the potential adverse effect in mitochondrial dynamics, because procaspase-3 appears to play an essential role in mitochondrial biogenesis.;파킨슨병은 수명이 길어짐에 따라 그 환자수가 급격히 늘어나고 있는 대표적인 신경퇴행성 질환 중의 하나이다. 대표적 병리학적 특징으로서 뇌의 흑색질에 존재하는 도파민 신경의 특이적인 사멸을 들 수 있다. 하지만 아직까지 병의 진행을 늦출 수 있는 효과적인 신경보호 치료법은 없으며, 대증요법만이 제한적으로 시행되고 있을 뿐이다. 따라서, 도파민 신경세포 사멸을 중단시키거나 늦출 수 있는 새로운 치료 타깃을 찾아내는 것이 시급하다. 아직까지 도파민 신경사멸의 정확한 기전은 알려지지 않았으나, 산화 스트레스가 가장 큰 원인 중의 하나로 제시되고 있다. 산화 스트레스를 유발하는 원인은 다양하게 알려져 있는데, 도파민의 대사와 자가산화, 미토콘드리아 기능장애, 신경염증, 노화 등이 이에 속한다. 또한, 유전성 파킨슨병과 관련된 유전자인 PINK1, parkin, DJ-1, α-synuclein, LRRK2 등에 돌연변이가 생길 경우 미토콘드리아의 기능장애가 나타나면서 산화 스트레스가 높아진다는 것이 알려져 있다. 이전의 연구들은 산화 스트레스가 직접적으로 세포손상을 유발할 뿐만 아니라 오토파지와 예정세포사에도 영향을 끼친다고 보고해왔다. 그러나, 파킨슨병 환자들에게 시행되었던 항산화요법은 효과를 보이지 않았고, 현재 도파민 보강용 치료제로 사용되고 있는 L-DOPA도 오히려 산화 스트레스를 악화시킬 수 있다는 문제가 있다. 따라서 이 논문에서는 산화적 스트레스에 의한 오토파지와 예정세포사의 이상을 조절할 수 있는 타깃을 찾음으로써 파킨슨병에서의 도파민 신경을 보호하고자 진행된 연구를 보고하였다. 먼저, 산화 스트레스에 의해 유발된 오토파지 이상 과정에서의 잠재적 치료타깃으로서 Oxi-α/Tnfaip8 단백질이 선택·연구되었다. 본 연구실에서는 기존에 순수한 도파민 세포주인 SN4741에서 산화 스트레스에 의해 특이적으로 조절되는 Oxi- gene/Tnfaip8 단백질 그룹을 발견했는데, Oxi-α는 그 중 하나로서 오토파지 억제에 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다. 산화 스트레스에 의해 Oxi-α의 발현은 감소했고, Oxi-gene의 또다른 단백질 중 하나인 Oxi-β를 증가했으며, 이 두 단백질이 mTOR의 인산화를 길항적으로 조절함으로써 오토파지를 조절하는 것이다. 그러나, 아직까지 mTOR 윗 단계에서의 Oxi-α 메커니즘은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 Oxi-α의 오토파지 관련 메커니즘을 밝히기 위해 간세포주에서 인슐린에 의해 오토파지가 억제되는 모델을 도입하였다. 연구 결과는 Oxi-α가 인슐린에 의해 발현이 증가되며, PE (Phosphatidylethanolamine), Gαi3와의 결합을 통해 ‘Oxi-α - PE - Gαi3’ 복합체를 형성하여 인슐린의 오토파지 억제작용을 중재한다는 것을 보여준다. 특히 X-ray crystallography와 LC-MS 분석법을 통해 Oxi-α가 구조적으로 소수성의 강(cavity)을 가지며 여기에 PE가 붙어있음을 밝혔다. 또한 PE가 붙을 수 없는 구조의 Oxi-α 돌연변이체의 경우, Oxi-α가 오토파지 억제 작용을 잃어버렸으며 Gαi3와도 결합하지 않음이 관찰되었다. 이는 PE가 Oxi-α의 오토파지 억제 작용에 중요한 요소임을 보여준다. 인슐린에 의해 세포 내 Oxi-α가 세포질에 퍼져 있다가 세포막 쪽으로 옮겨가는 것도 관찰되었는데, 이는 Oxi-α가 Gαi3와 세포막 가까이서 결합하여 인슐린의 오토파지 억제 신호를 전달할 수도 있음을 시사한다. 따라서 본 연구는 새로이 Oxi-α가 PE, Gαi3와 복합체를 형성하여 인슐린에 의한 오토파지 억제에 관여한다는 것을 보여주었으며, 이는 파킨슨병에서 산화 스트레스에 의해 발생한 오토파지 장애 뿐 아니라 당뇨 비만의 인슐린 내성을 치료하기 위한 새로운 타깃 규명에도 도움이 될 것으로 예상된다. 두번째로, 예정세포사를 조절함으로써 도파민 신경을 보호하는 방법으로, caspase-3 단백질에 대한 유전적 조절법이 선택·연구되었다. 본 연구에서는 caspase-3가 결여된 순수 도파민 신경세포주의 상태를 생리학적, 병리학적 조건에서 관찰했다. 예정세포사는 파킨슨병 질환자와 질환 모델에서 도파민 신경 사멸이 일어나는 것과 매우 밀접한 연관성이 보고 되어왔고, 따라서 예정세포사의 사형집행자 격인 caspase-3는 도파민 신경을 보호할 수 있는 약물 치료 타깃으로 오랫동안 제시되어 왔다. 하지만 예정세포사는 생화학적으로 매우 복잡한 과정이어서, caspase-3 조절이 세포전반에 미치는 영향이 고려될 필요성이 있다. 본 연구 결과는 caspase-3의 유전적 개입이 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제할 수는 있지만, 예상 밖의 심각한 미토콘드리아 기능 장애 또한 일으킬 수 있음을 보여준다. 구체적으로, caspase-3가 결여된 도파민 신경세포주에서는 산화스트레스 유도 물질(H2O2)에 의해 예정세포사의 개시자 격인 caspase-9가 활성화 되었음에도 불구하고, 세포사멸이 잘 일어나지 않았다. 그러나, caspase-3 결여 환경에서는 기본적인 산화스트레스의 레벨이 매우 높고, 구조적으로 부풀고 망가진 크리스테를 가진 미토콘드리아가 축적되어 있으며 미토콘드리아 막전위의 감소, 전자전달계 구성 효소의 결손이 일어나 있음이 관찰되었다. 또한 흥미롭게도, caspase-3 결여 도파민 세포에서 미토파지는 정상적으로 일어날 수 있지만 미토콘드리아 생성능력이 매우 저하되어 있음이 밝혀졌다. 정상 도파민 세포주에서 caspase-3의 발현을 억제시킨 경우에도 미토콘드리아 생성과 관련된 전사제어인자인 Tfam이나 Nrf-1의 레벨이 감소됨이 확인되었다. 하지만 이는 caspase-3의 활성화된 형태인 단백질 분해 효소(프로테아제)로서의 역할 때문은 아닌 것으로 보였다. 이는 procaspase-3가 세포사 관련 역할이 아닌, 미토콘드리아 생성에서 새로운 역할을 가질 수 있다는 것을 제시하기도 한다. 따라서, caspase-3를 타깃으로 세포예정사를 조절하려는 장기적 치료법은 미토콘드리아 생성 및 유지에의 악영향을 고려하여 신중하게 계획되어야 한다. 종합하여, 위 연구에서는 인슐린에 의한 오토파지 억제 과정에서 ‘Oxi-α - PE - Gαi3’ 복합체가 형성됨을 제시하였으며, 이는 Oxi-α가 기존에 밝혀진 Oxi-β와 함께 오토파지 장애를 조절할 수 있는 새로운 분자적 타깃으로서의 활용가능성이 있음을 보여준다. 또한 caspase-3의 억제를 통한 예정세포사의 조절이 산화 스트레스에 의한 도파민 신경세포 사멸을 억제할 수 있지만, 동시에 미토콘드리아 생성 과정에서 중요한 역할을 하므로 부작용의 가능성을 고려해야 함을 시사한다.