Enhanced Production of Therapeutic Polyketides Using Heterologous Production System

Abstract

에포틸론 (epothilone)은 강력한 항암제로써 튜불린 (tubulin)에 결합하여 미세소관 (microtubule)을 안정화시켜 암세포의 성장을 억제시킨다. 이자베필론 (ixabepilone)은 현재 유일하게 시판되어 사용되고 있는 에포틸론 유도체 약물로 2007년 유방암 치료제로 FDA의 승인을 얻었으며, 에포틸론 B의 반합성을 통하여 합성된다. 에포틸론은 믹소박테리움 (myxobacterium)인 소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)의 이차대사산물로써, 생산 균주의 긴 생장시간과 유전자 조작의 어려움으로 인하여 그 산업적 생산을 위한 유용성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서, 본 연구에서 에포틸론 생산을 위한 효율적 이종숙주 생산시스템을 개발하고자 하였다. 이전 연구에서, 소란지움 셀룰로섬 유래의 에포틸론 생합성 유전자 집단을 이종숙주 스트렙토마이세스 베네주엘래 (Streptomyces venezuelae)의 유전자서열을 고려하여 코돈 최적화 (codon-optimization)를 진행하였으며, 합성된 인공유전자를 피크로마이신 (pikromycin) 생합성 유전자집단이 삭제된 스트렙토마이세스 베네주엘래 돌연변이주에서 발현하여 1 μg/L 이하의 에포틸론 A의 생산을 확인하였다. 또한, 에포틸론 생산성 향상을 위하여, 수송 유전자 (transport gene)로 추정되는 orf6-3-14 유전자를 과발현 (overexpression)하여 10배 가량 증가 된 10 μg/L의 에포틸론 A의 생산을 확인하였다. 본 연구의 3장에서는, 인공 생합성 유전자를 이용하여 이종숙주 스트렙토마이세스 베네주엘레에서 향상된 에포틸론 생산성을 위한 추가 연구를 진행하였다. 우선적으로 거대 생합성 유전자집단 집단의 효율적 전사 (transcription)와 전령 RNA (messenger RNA)의 안정화를 위해 다시스트론성 시스템 (polycistronic system)을 단일시스트론성 시스템 (monocistronic system)으로 변경하였다. 이 때 기존의 양방향 pikA 프로모터 (divergent pikA promoter)를 한방향 pikA 프로모터 (convergent pikA promoter)로 수정하고, 전사 종결 (transcriptional termination)을 확실히 하기 위해 des 터미네이터 (des terminator)를 사용하였다. 그 결과 약 2 μg/L의 에포틸론 A의 생산을 확인하였으며, 이는 기존의 다시스트론성 시스템과 비교하여 2배 가량 증가된 생산성이다. 다음으로, 생합성 전구체 공급을 통해 에포틸론의 이종숙주 내 생산성 향상을 시도하였다. 이를 위해, 에포틸론 고유 전구체인 티아졸 다이케타이드 (thiazole diketide)를 화학 합성하였으며, 에포틸론 생산 스트렙토마이세스 베네주엘레에 배양 중에 공급을 통해, 에포틸론 A 및 B, C, D의 생산을 모두 확인하였으며 총 생산량은 15 μg/L 이다. 본 3장의 연구를 통해, 코돈 최적화된 인공 생합성 유전자를 이용한 이종숙주 스트렙토마이세스 베네주엘레에서의 에포틸론 생산이, 시스템 최적화 및 생합성 전구체 공급을 통하여 초기 생산량 대비 15배 가량 향상되는 결과를 확인할 수 있었다. 본 연구의 4장에서는, 전구체 유도 생합성 (precursor-directed biosynthesis) 방법을 이용하여 에포틸론 B의 선택적 생산을 위한 연구를 진행하였다. 천연화합물 (natural product)은 다양하고 복잡한 구조에 의해 다양한 생리활성을 나타내는데, 구조의 변형을 통해 독성은 줄이고 유용한 활성이 부여되거나 개선된 '비천연' 천연화합물 ('unnatural' natural product)을 얻을 수 있으며 이는 신약 개발이나 유용 화합물의 발굴에 중요한 원료로 사용될 수 있다. 전구체 유도 생합성은 다양한 구조의 전구체를 천연화합물 생합성 과정에 결합시킴으로써 손쉽게 천연화합물의 구조를 변형할 수 있는 방법으로, 원하는 구조의 화합물을 디자인 하는데 유용하다. 이종숙주 스트렙토마이세스 베네주엘레에서 에포틸론 B를 생합성하기 위해, 모듈 (module) 7, 8, 9와 에폭시데이즈 (epoxidase) 및 수송 단백질 (EpoD, EpoE, EpoF, 및 Orf6-3-14)을 발현하고, 모듈 7의 기질로 사용될 수 있는 헥사케타이드 (hexaketide)를 화학 합성하여 공급해주어, 소량의 에포틸론 D가 생산되는 것을 확인하였다. 목표 물질인 에포틸론 B의 생합성을 위해, 추가적으로 모듈 6 (EpoC-M6)을 발현하고 그에 해당하는 기질 펜타케타이드 (pentaketide)를 화학 합성하여 공급하는 전략으로 시스템 최적화를 수행하였다. 그 결과 약 8 μg/L의 에포틸론 B와 미량의 에포틸론 D의 생산을 확인하였다. 또한 이종숙주에 따른 효율을 비교하기 위해, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)를 이종숙주로 사용하는 전구체 유도 생합성 시스템을 제작하였다. 모듈 6, 7, 8, 9와 에폭시데이즈 (EpoC-M6, EpoD, EpoE, EpoF) 및 익스텐더 유닛 (extender unit)인 methylmalonyl-CoA의 생합성을 위한 pcc 유전자 집단을 발현해 주었으며, 펜타케타이드를 공급해 주어 약 3 μg/L의 에포틸론 D가 생산되는 것을 확인하였다. 에포틸론 생합성 과정의 마지막 단계인 EpoF는 전자 공급 (electron supply)이 필요한 촉매반응으로, 에스케리키아 콜라이에서는 이에 필요한 산화환원 파트너(redox partner)의 부재로 에포틸론 B가 생산되지 못했을 것으로 추측된다. 본 논문의 연구를 통하여, 유용 천연화합물의 이종숙주 생산시스템의 개발 및 생산성 향상을 위한 시스템 최적화에 대한 전략을 제안하였다. 또한, 전구체 유도 생합성 시스템 개발을 통해 목표 구조의 화합물 (에포틸론 B 또는 D)을 선택적으로 생산하는 방법을 보고하였다. 이는 향후 이종숙주 생산시스템을 이용하여 다양한 목표 화합물의 효율적 생산에 관한 연구에 기여할 것으로 예상된다.;Natural products obtained from diverse natural sources, such as bacteria, plants, and fungi, evince remarkable bioactivities that have continued to play an important and valuable role in medicine and human health as well as useful chemicals. Their diverse biological activities are shown due to their structural complexity and diversity. Therefore, there are many attempts to find new compounds or to generate novel compounds. Genetic engineering can be an efficient tool to get a large quantity of natural products and to create structural diversities of compounds from natural producing hosts. However, the native producers often grow slowly and have low productivity of secondary metabolites, and are genetically inaccessible. Moreover, chemical synthesis is economically unpractical to synthetize structurally complex compounds although it is indispensable for developing new antibiotics. For such reasons, the transfer of natural product biosynthetic pathway originated from the natural producer into heterologous hosts provides several benefits. Heterologous expression system enables easy engineering and expression of exogenous biosynthetic pathways which is difficult to manipulate. The target compound in this study, epothilone family, is a potent anticancer agent produced from the myxobacterium Sorangium cellulosum. They act similar to paclitaxel by stabilizing microtubules, which result in the prevention of cancer cells division and are effective against multiple-drug-resistant cancer cell lines. High-yield production and the generation of epothilone anlaogues are required because of these attractive properties. However, S. cellulosum, the natural host that produces epothilone naturally, is slow-growing (doubling time is approximately 16 h) and fastidious to genetic manipulations. Therefore, heterologous expression of biosynthetic gene cluster in an alternative host is necessary to overcom the disadvantages of the original producer. In part I, short summaries of natural product and epothilone are presented. Also, the advantages of heterologous host, strategies for enhanced production and analogue generation of natural products are summarized. Technical informations for this research are described in part II, Materials and Methods section. In previous study, the codon usage of entire epothilone biosynthetic gene cluster was optimized to the host and artificial genes were redesigned and reassembled for expression in heterologous host Streptomyces venezuelae. The mutant strains expressing artificial epothilone genes produced approximately less than 1 µg/L of epothilone A. Furthermore, addition of an extra copy including transport genes resulted the 10-fold increased epothilone A production. Part III gives the reports for improvement of epothilone production using these artificially synthesized genes in heterologous host, S. venezuelae. At first, the monocistronic expression system for the efficient transcription using modified pikA promoter was constructed to compare epothilone productivity with polycistronic system. Each polyketide synthase (PKS) / nonribosomal peptide synthetase (NRPS) genes together with putative transport genes encoding large proteins of epothilone biosynthesis were individually cloned and combined into two compatible Escherichia coli-Streptomyces shuttle vectors. The resultant S. venezuelae recombinant harboring monocistronic genes produced 2 µg/L of epothilone A, approximaterly 2-fold increased productivity. Following strategy was biosynthetic precursor supplementation. The thiazole diketide biosynthetic intermedidate which incorporates into module 3 of EpoC was synthesized as the N-acetylcysteamine (NAC) thioester and fed to the recombinant S. venezuelae expressing polycistronic epothilone genes. As a result, epothilone A as well as epothilone B, C, and D were detected above 15 µg/L titers. In part IV, precursor-directed biosynthesis systems were developed in S. venezuelae and E. coli hosts for the selective production of epothilone B and D. Precursor-directed biosynthesis is a convenient way for the creation of varied natural products or their analogues simply by changing the structures of the fed synthetic precursors. The partial pathways of epothilone biosynthesis were introduced: EpoD, EpoE, and EpoF corresponding to PKS module 7, 8, 9 and epoxidase were introduced in S. venezuelae. When the natural hexaketide-thioester, chemically synthesized, was supplemented to recombinant strain, a trace amount of epothilone D was detected by complementation of intermediate to deficient pathway. The expanded pathway containing module 6 of EpoC, EpoD, EpoE, and EpoF was constructed for the use of another natural pentaketide-thioester substrate. In this case, ~8 µg/L of epothilone B was mainly produced with small amount of epothilone D. To compare the efficiency of hosts, an alternative host, recombinant E. coli was constructed by expressing module 6 of epoC, epoD, epoE, and epoF genes originated S. cellulosum. The pentaketide-thioester was added to protein-induced cells and only epothilone D (~3 µg/L) was produced despite of the expression of epoF gene encoding epoxidase. A lack of redox partner for electron supply in E. coli host caused the EpoF incapable of conversion epothilone D to epothilone B. Titers of epothilone B or D resulting from conversion of fed synthetic precursors were approximately less than 10 µg/L. In summary, development of an efficient heterologous expression system for epothilone biosynthesis was attempted by construction of monocistronic expression system and supply of biosynthetic precursor, which increased the production of epothilone A, B, C, and D with above 15 µg/L titers. Furthermore, the desired epothilone B and D were able to be produced by precursor-directed biosynthesis system in heterologous host and this result showed the possibility of the generation of novel natural products through the diverse synthetic substrate incorporation.