Layered Double Hydroxide as Injectable Drug Delivery Nanovehicle with Targeting Function

Abstract

Chemotherapy with cytotoxic drugs is one of the most widely prescribed methods for treating various cancers. However, one serious problem associated with chemotherapy is the frequent development of tumor cell resistance to these agents during clinical treatment. For successful cancer therapy, high efficacy and low side effect drugs are highly needed, which might possibly be achieved by drug-nanoparticle hybrid systems. Recently, various inorganic nanomaterials have emerged as an important class of drug delivery systems in nanomedicine fields. Among them, layered double hydroxides (LDHs) have attracted a great deal of attention due to their ability to release drugs in a controlled manner, to facilitate cellular interaction, and enhance cellular uptake and eventually lead to a high efficacy of drugs. In our previous reports, we found that anticancer drugs-LDH nanohybrid systems could considerably enhance the cellular uptake of drugs and consequently suppress the cancer cell proliferation effectively as well. Furthermore we were able to clearly demonstrate that such a positive effect of an inorganic drug delivery vehicle is directly associated with the specific cellular uptake mechanism of LDH nanoparticles, namely, the clathrin-mediated endocytosis, the most common energy dependant endocytic pathway in all mammalian cells. In our previous studies, we reported the first example of a drug-LDH nanohybrid system to overcome drug resistance. Therefore, in this thesis, we evaluated the potential of injectable nanomedicine using our nano vehicle LDH. At first, in Chapter 1, the anticancer drug methotrexate (MTX) was successfully incorporated into the layered ceramic nanoparticles of layered double hydroxides (LDHs). The prepared MTX-LDH two-dimensional nanoassemblies showed enhanced chemical and thermal stability of intercalated MTX molecules through the effective electrostatic interaction with ceramic LDH layers. And the surface charge of MTX-LDHs was determined to be highly positive whereas that of MTX is fairly negative. The time-dependent cellular uptake of MTX determined by high performance liquid chromatography showed the much enhanced cellular drug concentration of MTX-LDH treated cancer cells than the MTX treated ones. The particle size of MTX-LDH nanoassemblies was estimated in various solutions such as saline, phosphate saline, and RPMI 1640 cell culture medium, showing that the hydrodynamic size maintains at ~100 nm, regardless of the suspension media. The positive surface charge and ~100 nm size of MTX-LDHs is considered to be the major factor in the high cellular uptake and enhanced drug efficacy. In Chapter 2, methotrexate, an anticancer agent, was successfully intercalated into the anionic clay, layered double hydroxides to form a new nanohybrid drug. The coprecipitation and subsequent hydrothermal method were used to prepare chemically, structurally, and morphologically well-defined two-dimensional drug-clay nanohybrid. The resulting two-dimensional drug-clay nanohybrid showed excellent colloidal stability not only in deionized water but also in an electrolyte solution of Dulbecco’s Modified Eagle Medium with 10% fetal bovine serum, in which the average particle size in colloid and the polydispersity index were determined to be around 100 nm and 0.250, respectively. The targeting property of the nanohybrid drug was confirmed by evaluating the tumor-to-blood and tumor-to-liver ratios of the methotrexate with anionic clay carrier, and these ratios were compared to those of free methotrexate in the C33A orthotopic cervical cancer model. The biodistribution studies indicated that the mice treated with the former showed 3.5-fold higher tumor-to-liver ratio and 5-fold higher tumor-to-blood ratio of methotrexate than those treated with the latter at 30 min post injection. In Chapter 3, the clinical efficacy of conventional chemotherapeutic agent, methotrexate (MTX), can be limited by its very short plasma half-life, the drug resistance, and the high dosage required for cancer cell suppression. In this study, a new drug delivery system is proposed to overcome such limitations. To realize such a system, MTX was intercalated into layered double hydroxides (LDHs), inorganic drug delivery vehicle, through a co-precipitation route to produce a MTX-LDH nanohybrid with an average particle size of approximately 130 nm. Biodistribution studies in mice bearing orthotopic human breast tumors revealed that the tumor-to-liver ratio of MTX in the MTX-LDH-treated-group was 6-fold higher than that of MTX-treated-one after drug treatment for 2 hr. Moreover, MTX-LDH exhibited superior targeting effect resulting in high antitumor efficacy inducing a 74.3% reduction in tumor volume compared to MTX alone, and as a consequence, significant survival benefits. Annexin-V and propidium iodine dual staining and TUNEL analysis showed that MTX-LDH induced a greater degree of apoptosis than free MTX. Taken together, our data demonstrate that a new MTX-LDH nanohybrid exhibits a superior efficacy profile and improved distribution compared to MTX alone and has the potential to enhance therapeutic efficacy via inhibition of tumor proliferation and induction of apoptosis. In Chapter 4, pemetrexed (PMX), an anticancer drug, was successfully intercalated into the inorganic nanovectors, layered double hydroxides (LDHs) to form a bio-nanohybrid drug. The coprecipitation and subsequent hydrothermal method were used to prepare the PMX-LDH-0.25eq, PMX-LDH-0.35eq, and PMX-LDH-0.50eq nanohybrids. The colloidal properties of PMX-LDH nanohyrids were evaluated to dynamic light scattering (DLS), and surface charges. The PMX-LDH-0.25eq nanohybrid has a positively charge of 38.1 mV. It is the fact that smaller amount of PMX into the LDH interlayer space could be increased surface charges of PMX-LDHs due to the less the neutralizing the charge of surface charges between the LDH and PMX molecules. The PMX-LDH-0.25eq nanohybrid has fairly stable colloidal property because it has a high electrostatic repulsion between nanoparticles. Also, the anticancer effect of colloidal PMX-LDH-0.25eq compared with free PMX was evaluated in the human lung adenocarcinoma cell culture lines A549 and H460, showing higher drug efficacy compare with free PMX treated cells. Finally in Chapter 5, we discussed about the conventional chemotherapeutic agent, pemetrexed (PMX), that was approved by the US Food and Drug Administration (FDA) as a first line therapy for advanced non-squamous NSCLC patients. In this study, PMX-inorganic nanostealth system is proposed to overcome the limitations such as very short plasma half-life, high rate of efflux relative to influx, and a high administration dose of PMX. PMX was intercalated into layered double hydroxides (LDHs), inorganic drug delivery vehicle, through a coprecipitation and subsequent hydrothermal method to form a PMX-LDH nanohybrid with an average particle size of approximately 100 nm. Biodistribution studies in the H460-fluc xenograft non-small cell lung cancer (NSCLC) mice model revealed that the tumor-to-liver ratio and tumor-to-blood ratio of PMX in the PMX-LDH-treated-group were 18-fold and 9-fold higher than that of PMX-treated-one after drug treatment for 2 hr, respectively. Moreover, PMX-LDH exhibited superior targeting effect resulting in high antitumor efficacy inducing a 60.8% reduction in tumor volume compared to PMX alone.;화학요법은 여러 암의 치료에 가장 널리 처방되는 방법 중 하나이다. 그러나, 화학요법과 관련된 심각한 문제는 임상 치료 중 화학요법 약물에 대한 종양 세포의 내성이 빈번하게 발생한다는 점이다. 성공적인 암 치료를 위해서는 이러한 부작용은 줄이고, 약물의 효능은 높일 수 있는 약물-무기 나노입자 하이브리드 시스템이 필요하다. 최근, 약물 및 생기능성 분자의 효율적인 전달을 위한 벡터로써의 무기 나노 재료의 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 나노의학 분야에서 약물 전달 시스템의 중요한 분야로 등장했다. 무기 나노 재료 중에서, 금속 이중층 수산화물(LDH)은 음이온성의 약물 및 생기능성 분자를 담지할 수 있고 세포 내 투과율은 높으며, 독성은 없기 때문에 유용한 약물 전달체이다. 또한, 금속 이중층 수산화물(LDH)은 표적지향성 약물 전달이 가능하며, 용출률 조절이 가능하기 때문에 부작용을 최소화하고 치료 효과를 증대시킬 수 있다는 장점을 가진다. 이전 연구에서 우리는 항암제-금속 이중층 수산화물(LDH) 나노하이브리드 시스템이 약물의 세포 흡수를 향상시키고, 효과적으로 암세포의 증식을 억제 할 수 있음을 증명하였다. 뿐만 아니라, 약물 전달체인 무기 나노 입자, 금속 이중층 수산화물(LDH)이 클라트린 매개 엔도사이토시스 (clathrin-mediated endocytosis) 메커니즘을 통해서 세포 내로 이입된 다는 것을 입증하였다. 또한, 우리의 이전 연구에서, 약제 내성을 극복하기 위한 항암제-금속 이중층 수산화물(LDH) 나노하이브리드 시스템을 보고한 바 있다. 따라서, 본 연구에서는 무기 나노 전달체인 금속 이중층 수산화물(LDH)을 이용하여 타겟팅 기능을 갖는 주사 가능한 나노메디슨으로써의 가능성을 평가하고자 한다. 먼저, 1장에서는 항암제인 메토트렉세이트(MTX)를 성공적으로 금속 이중층 수산화물(LDH)의 층간에 삽입하였다. 합성된 MTX-LDH 2차원 나노조립체는 세라믹 LDH와 층간에 삽입된 MTX 분자간에 정전기적 상호작용을 통해 MTX 분자의 화학적 안정성 및 열 안정성이 강화되었다. 표면전하 측정결과, MTX 분자의 표면전하는 음의전하를 나타내는 반면 MTX-LDH의 표면전하는 양의전하를 나타내었다. 또한, 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 측정한 MTX의 시간에 따른 세포내 흡수 농도는 MTX-LDH를 처리한 암세포에서 MTX를 처리한 암세포보다 높은 농도를 나타내었다. MTX-LDH의 입자 크기를 식염수, 인산완충식염수 및 RPMI 1640 세포 배양 배지와 같은 다양한 용매에서 측정한 결과 약 100 nm 의 크기를 나타내었다. 이와 같은 양성 표면 전하 및 100 nm 의 입자 크기는 높은 세포내 흡수율 및 향상된 약물 효능에 중요한 인자로 작용한다는 것을 확인하였다. 제 2 장에서는 메토트렉세이트(MTX)를 성공적으로 음이온성 점토인 금속 이중층 수산화물(LDH)의 층간에 삽입하여 새로운 나노하이브리드 약물을 형성하였다. 화학적, 구조적, 형태학적으로 명확한 2차원 약물-클레이 나노하이브리드를 공침 및 수열합성 방법을 이용하여 합성하였다. 합성된 2차원 약물-클레이 나노하이브리드는 탈이온수 뿐만 아니라, 10 % 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 세포배양액에서도 평균 입자 크기 약 100 nm 및 분산도 지수(PDI)가 0.250으로 우수한 콜로이드 안정성을 보였다. 나노하이브리드 약물의 표적지향성은 종양 대 혈액 및 종양 대 간에서의 MTX의 비율을 통해 평가하였다. 이러한 비율은 C33A 동소이식 자궁암 모델에서 MTX와 LDH-MTX를 각각 주사한 후 비교하였다. 생체 분포 연구에서 LDH-MTX를 주사한 마우스 그룹은 MTX를 주사한 마우스 그룹보다 약 3.5 배 높은 종양 대 간 비율을 나타냈으며, 약 5 배 높은 종양 대 혈액 비율을 나타냈다. 제 3 장, 종래의 화학요법 약물인 메토트렉세이트(MTX)는 매우 짧은 반감기, 약물 내성, 및 암 세포의 사멸을 위해서는 고용량의 MTX를 주사해야 한다는 단점을 가지고 있다. 본 연구에서는, 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 약물 전달 시스템을 제안하였다. 공침법을 이용하여 무기 약물 전달체인 금속 이중층 수산화물(LDH)의 층간에 MTX를 삽입하여 약 130 nm의 평균 입자 크기를 가지는 MTX-LDH 나노하이브리드를 합성하였다. 동소이식 유방암 마우스 모델에서의 생체 분포 연구는 MTX-LDH 처리 그룹에서 MTX의 종양 대 간 비율이 약물 투여 후 2 시간에 MTX 처리 그룹보다 6 배 높게 나타났다. 또한, MTX-LDH의 우수한 표적지향성 기능에 의해 MTX-LDH를 주사한 마우스 그룹에서 MTX를 주사한 마우스 그룹에 비하여 종양 부피가 74.3 % 더 감소하는 높은 항종양 효과가 나탔났으며, 그 결과 MTX-LDH를 주사한 마우스 그룹은 100 % 생존율을 보였다. 뿐만 아니라, 종양 조직의 TUNEL 분석결과 MTX-LDH를 주사한 마우스 그룹에서 MTX를 주사한 마우스 그룹보다 세포 사멸효과가 크게 나타나는 것을 알 수 있었다. 결론적으로, 새로운 MTX-LDH 나노하이브리드 시스템은 기존 MTX에 비해 우수한 효능 및 개선된 생체 분포를 나타내고, 세포 사멸의 유도와 종양 증식의 억제를 통해 치료 효과를 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지는 우수한 약물 전달 시스템이다. 4 장에서는, 항암제 페메트렉시드(PMX)를 무기 나노벡터인 금속 이중층 수산화물(LDH)의 층간에 삽입하여 성공적으로 바이오 나노하이브리드 약물을 합성하였다. 공침 및 수열합성 방법을 이용하여 PMX의 함량을 조절한 PMX-LDH-0.25당량, PMX-LDH-0.35당량 및 PMX-LDH-0.50당량의 나노하이브리드를 합성하였다. PMX-LDH 나노하이브리드의 콜로이드 특성은 동적 광산란법(DLS)과 표면 전하 분석을 통해 평가하였다. PMX-LDH-0.25당량 나노하이브리드는 +38.1 mV의 표면 전하를 나타내었으며, 이는 LDH 층간에 소량의 PMX로 인해 LDH와 PMX 분자간 전하의 중화가 충분히 일어나지 않아 PMX-LDH-0.25당량의 표면 전하가 PMX-LDH-0.35당량 및 PMX-LDH-0.50당량 보다 증가되었음을 보여주는 것이다. PMX-LDH-0.25당량 나노하이브리드는 입자 사이의 높은 정전기적 반발력을 가지고 있기 때문에 상당히 안정된 콜로이드 속성을 나타낸다. 또한, PMX 에 비해 콜로이드 PMX-LDH-0.25당량의 항암 효과가 폐암 세포주 A549 및 H460에서 높게 나타났다. 마지막으로 제 5 장에서, 매우 짧은 반감기를 가지며, 유입에 비해 상대적으로 높은 유출 속도로 인해 고용량을 주사해야 한다는 단점을 가지는 비소세포폐암의 화학요법 약물인 페메트렉시드(PMX)의 한계를 극복하기 위한 새로운 약물 전달 시스템으로써 PMX-무기 나노스텔스 시스템이 제안되었다. 공침 및 수열합성 방법을 이용하여 무기 약물 전달체인 금속 이중층 수산화물(LDH)의 층간에 PMX를 삽입하여 약 100 nm의 평균 입자 크기를 가지는 PMX-LDH 나노하이브리드를 합성하였다. 이종이식 폐암 마우스 모델에서의 생체 분포 연구는 PMX-LDH를 주사한 마우스 그룹에서 PMX의 종양 대 간 비율 및 종양 대 혈액 비율이 약물 투여 후 2 시간에 PMX 주사 그룹보다 각각 18 배와 9배 높게 나타났다. 또한, PMX-LDH의 뛰어난 표적지향성 기능에 의해 PMX-LDH를 주사한 마우스 그룹에서 PMX를 주사한 마우스 그룹에 비하여 종양 부피가 60.8 % 더 감소하는 우수한 항종양 효과를 보였다. 따라서, 본 연구를 통하여 무기 나노 전달체인 금속 이중층 수산화물(LDH)이 약물의 항종양 효과를 증대시킬 수 있는 타겟팅 기능을 갖는 주사 가능한 나노메디슨임을 증명하였다.