Molecular Signatures of Radiation-induced Pulmonary Fibrosis

Abstract

PART 1. In modern times, SBRT has been used as a way to treat only cancer cells by minimizing damage to normal tissue and developing radiation technology development. However, the molecular effects of limited lung volume focus exposure to high-dose per fraction radiation (HDFR) such as SBRT have not yet been fully understanding. We analyzed genes and proteins in mouse lungs using HDFR radiation systems similar to human therapy in this study. Focal high-dose IR (90 Gy) was irradiated to the left peripheral lung of 3-mm in volume using a small animal stereotactic irradiator. This volume is the size of the mouse regarding volume that is mainly irradiated in the clinic. Also, cDNA microarray and histological analysis for lungs were performed using lung tissue and a serum protein array of blood sera after HDFR IR until four weeks to identify IR-responsive genes and proteins. And the long-term effects (12 months) of diffused low-dose IR (20 Gy) into the whole left lung was also examined compare with HDFR-responsive gene and protein. The genes and proteins identified to respond to 90 Gy HDFR were krt15, bnc1, hoxc4, cidec, cst9, and gdf2 (down-regulation) and cd200r3, ermap, epb4.2 (up-regulation) and the proteins of Calponin (down-regulation), and AIF, laminin, bNOS, HSP27, b-amyloid (upregulation). Only three genes (cidec, cst9, and gdf2) were matched when compared with diffused low-dose radiation (20 Gy). These genes suggest universal responsive genes in irradiated mouse lungs. On the other hand, the proteins were not identified to match in both 90 Gy and 20 Gy. The downregulated protein, Calponin, showed a similar pattern to cDNA microarray data. This Calponin could be a possible HDFR-responsive serum biomarker that reflects gene alteration of irradiated lung tissue. The candidate genes and proteins were also found to react at lower doses of 20 Gy and 50 Gy HDFR. From the results, demonstrate candidate genes and proteins are HDFR-specifically expressed in HDFR-induced lung injury associated with human SBRT. PART 2. Radiotherapy is one of the major therapies for lung cancer patients. However, most of the patients receiving radiation show IR-induced pulmonary fibrosis. To identify the molecular characteristics of IR-induced fibrosis, we investigated the fibrosis development in lung tissues irradiated. High-dose focal IR (90 Gy) was irradiated to the left peripheral lung of 3-mm in volume. This volume is the size of the mouse regarding volume that is mainly irradiated in the clinic. In the diffused low-dose mouse model, 20 Gy dose delivered in 7-mm volumes were exposed as a whole covering the left lungs. In the 90 Gy model, histological examinations of the IR irradiated areas and non-irradiated neighboring areas for 4 weeks after radiation were performed. And the long-term (12 months) effects of 20 Gy IR was compared with the diffused left lung and the non-irradiated right lung tissue. Fibrosis development began early 2 weeks in the irradiated area and non-irradiated neighboring area after HDFR (90 Gy). Upregulation of gtse1 was observed in both the 90 Gy irradiated area and the neighboring area, and upregulation of fgl1 was found in 20 Gy diffused irradiated and non-irradiated area. When gtse1or fgl1 was knock-downed in the cell system, epithelial-mesenchymal transition induced by IR or TGFb were suppressed and accompanied by the inhibition of cell migration was confirmed. These results are suggesting that it is the responsible gene of fibrosis. Immunostaining data using mouse fibrotic lung tissue observed that the expression of Gtse1 and Fgl1 was elevated in the fibrotic area. Indicating that these two genes may be new molecular markers for pulmonary fibrosis. Although the molecular mechanisms for pulmonary fibrosis may different from IR doses or volumes, these genes could be a new target for therapeutic strategies and may help understand IR-induced pulmonary fibrosis. ;폐암의 치료에는 수술적 요법, 방사선치료, 항암약물치료 등 다양한 방법이 시도되고 있다. 방사선치료는 주요 치료 방법으로 암 치료에 있어서 핵심적인 역할을 수행해 왔다. 특히, 컴퓨터 영상기법의 발달과 기계공학의 발달에 의해 암 환자의 60-70%가 방사선 치료를 받는 시대가 되었다. 이런 기술 개발 덕분에 현대에는 과거에 비해 정상조직의 손상을 최소화하고 암 세포만을 표적으로 하여 정밀하게 치료하여 부작용을 최소화 시킬 수 있는 고선량 저분할 방사선(SBRT; stereotactic body radiotherapy)이 사용되고 있다. 하지만 방사선 치료를 받는 전체 환자의 약 70-80%는 경증 또는 중증도의 부작용이 발생하며 만성적인 부작용으로 방사선 치료 주변의 폐가 딱딱하게 굳는 폐 섬유화 (Lung fibrosis)가 발생하게 된다. 현재까지 방사선에 의한 손상 인자 및 폐 섬유화 진단 치료 표적이 없는 실정이며 이런 인자 발굴은 폐 섬유화의 발병 기전을 규명할 수 있고 더 나아가 방사선 폐 섬유화 치료제개발을 위한 표적으로 적용 가능할 것이다. 따라서, 본 연구에서는 두 종류의 마우스 모델을 이용하여 방사선 조사에 의한 폐 손상, 더 나아가 폐 섬유화 과정에 관여하는 유전자를 찾기 위해 연구를 수행하였다. 먼저, 고 선량 방사선 조사(HDFR; High-dose per Fraction Radiation) 모델은 임상적인 방사선 치료 범위를 고려하여 90 Gy의 고용량 방사선을 왼쪽폐에 3mm크기로 조사하였다. 두 번째 모델은 기존의 전형적인 방사선 조사 방법인 저 선량 다분할 방사선 (Diffused Low-dose Radiation)으로 20 Gy의 저 선량을 왼쪽 폐에 7mm로 조사하였다. 이들의 폐 조직을 이용하여 cDNA 마이크로 어레이 (Microarray)와 마우스 혈청의 단백질 어레이 (Protein array)를 수행하였다. PART 1 결과에서 90 Gy HDFR에 반응하는 유전자와 단백질은 다음과 같이 확인되었다. 하향조절 (Down-regulation)유전자는 krt15, hoxc4, gdf2, cst9, cidec 및 bnc1이며, 상향조절 (Up-regulation)유전자는 ermap, epb4.2, cd200r3으로 조사되었다. 반응 단백질에는 하향 조절된 Calponin과 상향 조절된 AIF, Laminin, bNOS, HSP27, b-amyloid로 조사되었다. 20 Gy 저 선량 방사선과 비교하였을 때 gdf2, cst9, cidec이 두 방사선 모델에서 일치하였다. 이 세 유전자들은 방사선에 보편적인 반응 유전자로 제시 할 수 있겠다. 반면, 90 Gy와 20 Gy 방사선에 일치하는 단백질은 없었다. 하향 조절된 단백질인 Calponin은 마이크로 어레이와 비슷한 패턴을 보였는데, 이는 Calponin이 방사선 조사 된 폐 조직의 유전자 변형을 반영하는 HDFR 반응 혈청 마커일 수 있음을 시사한다. 위에서 조사된 후보 유전자와 단백질도 20 Gy와 50 Gy HDFR의 낮은 용량에서도 반응하였다. PART 2에서는 방사선 유도 폐 섬유화의 분자적 특성을 알아보기 위해 방사선이 조사된 마우스 폐 조직에서의 섬유화 과정을 조사하였다. HDFR 방사선 조사 후 4주동안 조사 부위와 조사부위의 이웃 부위 조직에 대해, 20 Gy의 저 선량 방사선의 경우 왼쪽 폐와 비 조사된 오른쪽 폐 부위의 조직에 대해 검사를 수행하였다. 섬유화는 조사된 부위 및 그 이웃 부위 모두에서 관찰되었다. HDFR방사선 조사 부위와 그 이웃 부위 모두를 고려한 마이크로 어레이 결과 상향 조절된 gtse1 유전자가 관찰되었고, 20 Gy 저 선량 방사선의 경우 fgl1유전자가 관찰되었다. 이들 유전자의 siRNA의 knock-down 시스템을 이용하여 방사선 또는 TGF에 의한 EMT (Epithelial-Mesenchymal transition)가 억제됨을 확인하였으며, 섬유화에 원인이 되는 유전자임을 제안할 수 있다. 또한, 폐 조직을 이용한 면역 형광 분석 (Immunofluorescence analysis)결과 섬유화 부위의 Gtse1과 Fgl1의 발현이 증가됨을 확인하였으며, 이는 방사선 유도 폐 섬유화에 대한 새로운 유전자임을 제시한다. 이 유전자는 방사선 폐 섬유화를 이해하고 치료 전략에 대한 새로운 목표일 수도 있음을 제안한다.