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Cytochrome P450 유전자의 이종 발현을 통한 허복시디엔의 신규 유도체 생산과 herA 조절유전자의 기능 규명

Title
Cytochrome P450 유전자의 이종 발현을 통한 허복시디엔의 신규 유도체 생산과 herA 조절유전자의 기능 규명
Other Titles
Production of New Herboxidiene Derivative by Heterologous Expression of Cytochrome P450 Gene and Functional Analysis of a herA Regulator
Authors
박지연
Issue Date
2013
Department/Major
대학원 화학·나노과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
윤여준
Abstract
Herboxidiene is a polyketide with herbicidal and anticancer activities. In this study, to produce novel derivative of herboxidiene, cytochrome P450 genes with known function was selected and introduced in Streptomyces chromofuscus A7847 and Streptomyces venezuelae (YJ028). S. venezuelae (YJ028) bearing a deletion of native pikromycin polyketide synthase and desosamine gene cluster. In case of introducing epoF gene produced novel compound in S. chromofuscus A7847 and S. venezuelae (YJ028). EpoF is cytochrome P450 epoxidase involved in biosynthesis of epothilone in Sorangium celluloosum. According to the known function of epoF gene, epoxidation of double bond at C-8 or C-10 position, in herboxidiene was expected. The herA gene is biosynthetic regulatory gene, and to investigate its function as regulatory gene, it overexpressed in S.chromofuscus A7847. The role of herA was assumed as negative regulator on the basis of its protein sequence. Introduction of herA gene led to decreased productivity of herboxidiene when compared with S. chromofuscus A7847 in herboxidiene production media and R2YE agar media. Reverse transcription-PCR (RT-PCR) was conducted to analyze gene transcription level of the wild type strain and mutant strain, and found that expression of biosynthetic genes was repressed when we overexpressed herA gene. Therefore herA gene was observed negative regulator in herboxidiene biosynthesis. ;본 연구는 Streptomyces chromofuscus A7847이 생산하는 이차대사산물인 허복시디엔 (herboxidiene)의 신규 유도체 생산과 생합성 조절유전자의 기능 규명에 관한 연구 결과이다. 허복시디엔은 polyketide계열 화합물로 제초활성과 항암활성을 갖기 때문에 신규 유도체 생산을 통하여 더 나은 활성을 갖는 후보물질을 발굴하려는 목적이다. 본 연구에서는 신규 유도체 생산을 위하여 기능이 밝혀진 cytochrome P450 유전자 5종을 선별하여 허복시디엔을 생산하는 S. chromofuscus A7847과 이종숙주인 Streptomyces venezuelae (YJ028)에 도입하였다. 5종의 cytochrome P450 유전자 중에서 Sorangium cellulosum의 epoF 유전자를 도입한 경우 S. chromofuscus A7847과 S. venezuelae (YJ028) 이종숙주균주 모두에서 허복시디엔의 신규 유도체로 예상되는 물질이 생산되는 것을 확인하였다. 신규 유도체의 확인은 HPLC-ESI-MS를 통하여, 허복시디엔 (m/z=455)과 허복시디엔의 구조 중 한 부분이 epoxidation 되었을 것으로 예상되는 신규 유도체 (m/z=471)를 분석하였다. S. cellulosum 유래의 epoF 유전자는 epothilone을 생합성 하는 과정에서 epoxidase로 작용하는 유전자로, S. chromofuscus A7847로 이종 발현 후에도 같은 기능을 할 것으로 예상 하였으며 HPLC-ESI-MS 결과 구조의 위치는 8번 탄소와 10번 탄소 위치의 이중결합 중 한 곳의 이중결합이 에폭시 고리로 변환된 것으로 예측하고있다. 허복시디엔 생합성에 관여하는 조절유전자인 herA 유전자의 기능을 규명하기 위하여 S. chromofuscus A7847에 herA 유전자를 과발현하였다. herA 유전자의 단백질 서열을 비교 분석하여 LacI family transcriptional regulator에 속하며 negative regulator로 작용할 것으로 예상할 수 있었다. herA 유전자의 과발현을 통하여 허복시디엔 생산액체배지와 R2YE 고체배지 모두에서 허복시디엔의 생산량이 감소함을 확인하였다. 이에 herA의 과발현이 허복시디엔 생합성 유전자 집단에 주는 영향을 분석하기 위하여 S. chromofuscus A7847과 herA 유전자를 과발현시킨 균주의 DNA 전사 수준을 분석하였다. 분석결과 herA 유전자를 과발현시킨 돌연변이 균주에서는 야생균주보다 허복시디엔 생합성 유전자 집단의 전사 수준이 감소하였음을 확인하였다. 본 연구에서는 이종 유전자의 발현을 통하여 허복시디엔 신규 유도체 생산 가능성을 제시할 수 있었으며, herA 조절유전자의 과발현을 통하여 허복시디엔 생산의 억제자 (repressor)역할을 함을 규명하였다.
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일반대학원 > 화학·나노과학과 > Theses_Master
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