Defensive role of sAPPα release against oxidative stress in HT-22 hippocampal cells

Abstract

Oxidative stress caused by an imbalance between reactive oxygen species (ROS) and antioxidants plays important roles not only in normal cellular processes but also in diverse pathophysiological processes. Especially, in the central nervous system, oxidative stress has been implicated as a major risk factor leading to cell death in acute and chronic degenerative diseases. Therefore, in neuronal cells, there is a need to have specific defense mechanisms against oxidative stress. Links between oxidative stress and proteolytic processing of amyloid precursor protein (APP) have been recently demonstrated in SK-N-MC human neuroblastoma cell lines and the HT-22 mouse hippocampal cell lines. The cells were inclined to have resistance to oxidative stress and it might be related with enhanced non-amyloidogenic cleavage of the APP leading to an increase in the release of soluble APP alpha (sAPPα), which has been known to protect neurons from excitotoxic, metabolic, and oxidative insults. In this study, an increase in the sAPPα release was proposed as one of the potential defense mechanisms against oxidative stress. First, effects of H2O2 on the HT-22 cell viability and the sAPPα release were examined. The hippocampal cells maintained their viability via sAPPα release enhancement when the cells were exposed to relatively high concentrations of H2O2 (≤750 μM) for 24 hours. Next, it was addressed to find the mechanisms for the regulation of sAPPα release under oxidative stress. Of particular interest was a member of the melastatin subfamily of transient receptor potential (TRP), especially TRMP2, which is a ROS-gated Ca2+-permeable nonselective cation channel. TRPM2 inhibitors, ACA and FFA, were tested to investigate whether Ca2+ influx via TRPM2 is involved in the regulation of sAPPα release. Treatment of TRPM2 inhibitors blocked the H2O2 (500 μM)-induced increase of sAPPα release, and concomitantly reduced the cell viability. In the condition of TRPM2 depletion using siRNA, the H2O2 (1 mM)-induced enhancement of sAPPα release observed in only transfection reagent-treated cells was not produced in TRPM2 siRNA-transfected cells. These data suggest that TRPM2 is involved in the regulation of sAPPα release for the defense against H2O2. As it was previously demonstrated that NF-κB activation via capacitative Ca2+ entry (CCE) was involved in regulating the sAPPα release mediated by muscarinic receptor activation in neuronal cells, it was examined whether the NF-κB can also regulate the H2O2-induced changes of sAPPα release. Pre-treatment of NF-κB inhibitors, SN50 or BAY11-7085, followed by an exposure to H2O2 (500 μM) significantly suppressed the H2O2-induced enhancement of sAPPα release. This result indicates the possibility of the involvement of NF-κB activation in the defense mechanism of sAPPα release enhancement against oxidative stress-induced neuronal cell death. Secondly, a disruption of iron homeostasis has been found to play a role in the etiology of neurodegenerative diseases, and α-secretase cleavage of APP was demonstrated to be regulated by iron in vitro, establishing a possible physiological role of iron in controlling the processing of APP. In this study, it was examined whether the level of sAPPα release is altered by using HBED, a synthetic lipophilic cell-permeable iron chelator. Treatment of HBED only reduced the cell viability accompanied by declines of sAPPα release, presumable because of the chelation of essential iron in neuronal cells. However, when the cells were pre-treated with HBED followed by exposure to H2O2 at highly cytotoxic concentration (1 and 2 mM), a significant increase of sAPPα release and dramatic enhancement of cell viability were observed. These results suggest that HBED has the protective effect via sAPPα release enhancement against H2O2-induced cell death, by chelating of iron with cytotoxic effect under the oxidative stress. In summary, an increase of sAPPα release was hypothesized as one of potential defense mechanisms against H2O2-induced neuronal cell death in this study. It was demonstrated that Ca2+ influx via TRPM2 and NF-κB activation are involved in the regulation of sAPPα release, and iron chelating activity of HBED also contributes to the defensive role of sAPPα release enhancement against oxidative stress.;활성 산소종으로 대표되는 생체 내 산화물질들과 이를 제거하는 항산화 시스템 간의 불균형에 의해 유발되는 산화적 스트레스는 정상 생리과정뿐만 아니라 다양한 병태생리학적 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 특히, 중추신경계에서 산화적 스트레스는 급, 만성 신경퇴행성 질환들을 유발하는 주요 인자로 알려져 있으므로 산화적 스트레스에 대한 신경세포 내 방어기전이 중요하다. 최근 산화적 스트레스와 아밀로이드 전구 단백질 (amyloid precursor protein; APP)의 단백분해과정 사이의 연관성이 SK-N-MC 인간 신경아세포종 (neuroblastoma) 세포주 및 HT-22 마우스 해마 세포주에서 보고된 바 있다. 즉, 산화적 스트레스에 대한 저항성을 갖는 신경세포에서 APP의 non-amyloidogenic cleavage의 증가로 인한 sAPPα의 분비 증가가 나타날 수 있음을 시사하고 있다. sAPPα는 흥분성, 대사성, 산화성 자극으로부터 신경을 보호하는 것으로 알려져 왔기 때문에 본 연구에서는 산화적 스트레스에 대한 방어기전의 하나로, sAPPα의 분비 증가를 제시하였다. 우선, 과산화수소(H2O2)가 HT-22 세포의 생존력과 sAPPα의 분비에 어떤 영향을 끼치는지 조사하였다. 독성이 있을 것으로 예상되는 비교적 높은 농도(750 μM)까지 H2O2를 HT-22 세포에 처리하였을 때, sAPPα의 분비 증가와 함께 생존력이 유지되는 것을 관찰하였다. 산화적 스트레스 하에서 sAPPα의 분비가 조절되는 기전을 밝히기 위해 특별히 주목한 것은 transient receptor potential (TRP)의 멜라스타틴 아과(subfamily)에 속하는 칼슘투과성 양이온 채널인 TRPM2로서 이 채널은 활성 산소종에 의해 활성화 된다고 알려져 있다. 활성 산소종 자극에 의한 TRPM2-경유 칼슘의 유입이 sAPPα의 분비 조절에 관여하는지 알아보기 위해 TRPM2 저해제(ACA 또는 FFA)를 전처리 했을 때 세포의 생존력이 감소됨과 동시에, H2O2에 의한 sAPPα의 분비 증가가 억제되었다. 이를 한번 더 확인하기 의해 간섭 RNA (siRNA)를 이용한 결과, TRPM2 siRNA를 처리하지 않은 세포에서 나타난 H2O2에 의한 sAPPα의 분비 증가가 TRPM2 siRNA를 처리한 세포에서는 일어나지 않았다. 이러한 결과는 TRPM2가 H2O2에 의한 산화적 세포 독성에 대한 방어기전으로 sAPPα의 분비 조절에 관여함을 시사한다. 이전 연구에서 무스카린성 수용체를 매개로 하여 TRPC를 경유한 칼슘 유입을 통해 NF-κB가 활성화되고 활성화된 NF-κB가 sAPPα의 분비 조절에 관여한다는 것이 밝혀졌기 때문에, 이번 연구에서는 NF-κB의 활성화가 H2O2에 의해 유도되는 sAPPα의 분비 변화에도 관여하는지를 조사하였다. NF-κB 저해제(SN50 또는 BAY11-7085)를 전처리한 경우, H2O2에 의해 유도되는 sAPPα의 분비 증가가 현저하게 억제되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 NF-κB의 활성화가 sAPPα의 분비 기전에 관여하며, 이를 통해 H2O2에 의한 세포 독성에 대한 방어에 기여한다는 것을 시사한다. 한편, 철의 항상성 파괴는 신경퇴행성 질환의 병인으로 작용한다고 알려져 왔고, APP의 processing이 철에 의해 조절된다는 것이 보고된 바 있다. 본 연구에서는 산화적 스트레스에 의한 세포 내 철의 항상성 파괴로 인한 독성과 이에 대한 방어기전으로 α-secretase에 의한 APP의 cleavage 조절을 통해 신경세포의 생존이 조절될 수 있는지 세포투과성 철 킬레이터로 알려진 HBED를 이용하여 조사하였다. HBED 단독 처리에 의해서는 sAPPα의 분비가 용량 의존적으로 감소됨과 동시에 세포의 생존력도 감소됨을 관찰하였고 이는 신경세포 생존에 필수적인 철이 제거되었기 때문이라고 예측할 수 있다. 이와는 반대로, HBED는 신경세포가 많이 사멸되는 고농도의 H2O2 (1 또는 2 mM) 처리에 의해 현저히 저하되는 sAPPα의 분비와 세포 내 holoAPP의 양을 크게 증가시켰고 이와 함께 세포의 생존력도 현저히 증가됨을 관찰하였다. 이러한 결과는 HBED가 sAPPα의 분비를 증가시킴으로써 H2O2에 의한 세포 독성에 대한 방어 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 본 연구결과들은 sAPPα의 분비 증가가 산화적 스트레스로 인한 세포 독성에 대한 효과적인 방어기전이 될 수 있으며, 더 나아가 산화적 스트레스에 대한 방어기전으로써 sAPPα의 분비 조절에 TRPM2를 경유하는 칼슘의 유입과 NF-κB의 활성화가 관여된다는 증거를 제시하였다. 또한 철 킬레이터인 HBED의 산화적 스트레스에 대한 신경보호작용에 sAPPα의 분비 증가라는 방어기전이 기여함을 시사하였다.