The role of p190 RhoA-specific guanine nucleotide exchange factor, Rgnef, in B cell activation during T cell-dependent immune response

Abstract

p190RhoGEF (Rgnef), a guanine nucleotide exchange factor (GEF), plays a role in actin re-arrangement and cell motility by regulating the activity of RhoA and focal adhesion kinase (FAK). In immune cells, Rgnef was first identified as a protein that the expression was induced following CD40 stimulation in B cells. Studies in our laboratory showed that Rgnef overexpression mimicked the activation events by CD40 stimulation, such as NK-B activation and morphology changes. Previous studies also showed increased expression of transcription factors, such as Blimp-1 and IRF4, that are involved in driving B cells into plasma cell stage. The present study investigates the role of Rgnef in B cell biology in vivo, especially in B cell differentiation into plasma cells, using mouse models including transgenic (Tg) mice that overexpress Rgnef (WT or DN form) in B cells and Rgnef KO mice. Analysis of B cell population in these mice showed that Rgnef is not required for B cell development in the bone marrow (BM). Analysis of B cell subsets of the spleen in these mice also showed no significant difference, although plasma cell population was slightly increased in Rgnef WT-Tg mice and was visibly reduced in KO mice. Similarly, the serum level of immunoglobulin (Ig) was increased in WT-Tg mice. These results suggest Rgnef over expression in B cells may play a role in the stage of plasma cell differentiation. To analyze further roles of Rgnef in the final differentiation stage of B cells into plasma cells, T cell-dependent (TD) immune response was induced in Rgnef WT- or DN-Tg mice as well as KO mice. After 7days of immunization, Rgnef WT-Tg mice showed increased populations of GC B cells and plasma cells. Especially, antigen-specific plasma cell population was significantly increased. Serum Ig level was also increased in WT-Tg mice. In contrast, Rgnef KO mice did not show antigen-specific plasma cell generation as well as antigen-specific Ig secretion in serum. Because previous studies in our laboratory showed that Rgnef is also expressed in antigen-presenting cells such as macrophage and dendritic cells, further studies were carried out to demonstrate that the results obtained during TD-immune response are due to the Rgnef function in B cells. When combination of B cells isolated from each mouse genotype and T cells from littermate (LtM) mice was transferred into Rag1 KO mice, antigen-specific plasma cell population was also increased in WT-Tg B cell-transferred mice after TD-antigen immunization. Rgnef DN-Tg or KO B cell-transferred mice did not show antigen-specific plasma cell population after TD-antigen immunization. These results further confirm that Rgnef function in B cells drives final stage of B cell differentiation into plasma cells. To investigate how Rgnef functions in B cells during TD immune response, expression levels of surface markers and transcription factors, as well as abilities for migration and B-T cell interaction were compared in B cells isolated from LtM, Rgnef WT- or DN-Tg, and KO mice. When B cells were activated by CD40 stimulation, chemokine-mediated migration was increased in LtM and WT-Tg B cells. In contrast, Rgnef DN-Tg and KO B cells showed increased adhesion rather than migration toward chemokines. Additionally, KO B cells were not able to conjugate properly with T cells in the presence of super-antigen SEB. Expression of surface molecules such as CD86, ICAM-1 and MHC class II was similar in all B cells. However, expression of transcription factors that are known to drive plasma cell differentiation such as Blimp-1 and IRF4 was increased in WT-Tg B cells. Collectively, these results suggest that Rgnef may actively participate in germinal center reaction and B cell differentiation stage toward plasma cells, either by regulating transcription factor expression or B cell circulation/conjugation by actin rearrangement.;P190RhoGEF (Rgnef)는 RhoA 특이적 guanine nucleotide exchange factor (GEF)로 Focal adhesion kinase (FAK)와 RhoA의 활성화를 조절하여 세포 내의 actin 재배열과 세포의 운동성을 조절하는 역할을 한다. 우리 실험실에서는 B 임파구가 CD40에 의해 활성화 될 때 Rgnef 단백질 발현이 증가됨을 처음으로 보고하였고, Rgnef가 과 발현된 B 세포에서 NF-B가 활성화되고 세포의 크기가 증가하는 현상을 보았다. 이는 B 세포가 CD40 자극을 받아 활성화 될 때 나타나는 현상과 동일하다. Rgnef 과 발현 세포에서 항체생산세포 분화에 관여하는 전사인자 (Blimp-1과 IRF4)의 발현이 증가하는 것 또한 확인하였다. 따라서 이 논문에서는 T 세포 의존적 면역반응이 일어날 때 B 임파구에서의 Rgnef의 기능을 동물 수준에서 알아보고자 하였다. 이를 위해 Rgnef의 야생형 (WT) 또는 점 돌연변이 (DN)를 과 발현하는 형질전환 (Tg) 마우스와 Rgnef가 결여 (KO)된 마우스를 사용하였다. 이들 마우스에서 B 임파구의 발생과 성숙을 확인한 결과 모든 마우스에서 B 임파구의 발생 및 성숙이 정상적으로 일어났다. 반면에 면역반응에 관여하는 GC B 임파구와 항체생산세포를 비교한 결과 GC B임파구는 마우스 간에서 큰 차이가 없었지만 항체생산세포와 항체 생산량은 Rgnef-WT 마우스에서 확연히 증가하였다. 이와는 달리 Rgnef-KO 마우스는 항체생산세포와 항체 생산량이 감소하게 나타났다. 이러한 결과들을 통해 B 임파구에서 발현되는 Rgnef가 항체생산세포로의 분화를 조절할 수 있다고 예상할 수 있었다. 이러한 예상이 생체 내 반응에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위해 T 임파구 의존적 항원인 NP-KLH를 마우스의 복강에 주입하여 면역반응을 유도하였다. 7일 뒤에 마우스를 희생시켜 GC B 임파구와 항체생산세포를 분석하였다. Rgnef WT-Tg 마우스에서 GC B 임파구와 항원 특이적인 항체생산세포가 증가하였으며 혈청 내에 존재하는 항원 특이적 항체의 양도 증가한 것에 반하여 Rgnef KO 마우스에서는 이 두 가지가 모두 감소하였다. 본 실험에 사용된 Rgnef 과 발현 마우스는 대식세포와 수지상세포에서도 Rgnef를 과 발현하고 Rgnef KO 마우스는 모든 세포에서 Rgnef 발현을 제거한 마우스이므로 위의 결과들이 B 임파구에 존재하는 Rgnef에 의한 현상인지 확인하고자 하였다. B, T 임파구가 결여된 마우스에 Rgnef의 형질이 다른 마우스에서 분리한 B 임파구와 정상 마우스에서 분리한 T 임파구를 이식하여 실험하였다. Rgnef WT-Tg 마우스의 B 임파구를 제공받은 마우스에서는 항원 특이적인 항체생산세포와 항체 생산 능력이 증가하였다. 반면, KO B 임파구를 제공받은 마우스에서는 대조군과 비교했을 때 항체생산세포가 감소하고 항원 특이적 항체 IgG1의 생산량이 감소하였다. 이를 통해 Rgnef WT-Tg 마우스에서 증가한 면역반응들은 B 임파구에 존재하는 Rgnef에 의해 매개됨을 확인하였다. 면역반응이 일어나는 동안 B 임파구에서 Rgnef가 어떠한 기능을 하는지 알아보기 위해 Rgnef 형질전환 마우스 B 임파구의 표면단백질과 전사인자의 변화를 비교하였다. CD40 자극에 의해 발현이 증가되는 표면단백질인 CD86, ICAM-1과 MHC class II의 발현은 대조군과 KO B 임파구 간의 차이가 나타나지 않았고 WT-Tg B 임파구에서 항체생산세포 형성에 관여하는 전사인자인 Blimp-1과 IRF4의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 또한 GC에서 CXCL12에 의해 유도되는 B 임파구의 이동성이 항원 특이적 항체 생산에 중요하기 때문에 Rgnef의 형질전환 마우스로부터 분리한 B 임파구의 이동성을 비교 분석하였다. 대조군과 WT-Tg B 임파구는 CXCL12에 대한 이동성이 증가한 반면 DN-Tg와 KO 마우스로부터 분리한 B 임파구의 이동성은 감소하였다. 또한, KO B 임파구에서는 SEB 항원이 존재할 때 T 임파구와 상호작용에 의해 형성되는 면역시냅스 (IS)가 감소하였다. 이런 결과들을 종합해 볼 때 Rgnef는 T 세포 의존적 면역반응 동안에 GC 반응과 항원 특이적인 항체생산세포의 분화에 관여할 것이라 예상할 수 있으며, 이러한 현상은 B 임파구의 전사인자 발현 조절이나 actin의 재배열을 통한 T 임파구와의 상호작용 및 GC안에서의 이동성에 의해 나타날 것으로 예상된다.