Function of BRG1 in DNA damage response and its application in cancer radiotherapy

Abstract

Upon generation of DNA double-strand breaks (DSBs), the highly coordinated signaling pathways are activated leading to cell cycle arrest, DNA repair and apoptosis, which is collectively known as DNA damage response. Radiotherapy are designed to kill cancer cells mostly by inducing DNA damage. However, DNA repair in tumor cells often leads to radioresistance and unsuccessful treatment. Our laboratory have previously shown that BRG1, the catalytic subunit of SWI/SNF chromatin remodeling complex, play a direct role in DSB repair by localizing at the sites of DNA breaks. However, the regulatory mechanisms that control their functions are largely unknown. In this thesis, I investigated the molecular mechanisms that regulate the functions of SWI/SNF in DSB repair and its applications in cancer radiotherapy. The aim of the first part of my thesis was to elucidate the regulatory mechanisms accounting for the previous finding of our laboratory that SWI/SNF facilitates DSB repair by stimulating the phosphorylation of histone H2AX at Ser-139 (S139ph) after DNA damage. I show that ATM mediates the phosphorylation of BRG1, the catalytic ATPase of the SWI/SNF complex, at Ser-721 rapidly after DNA damage. Phosphorylated BRG1 binds γ-H2AX (the phosphorylated form of H2AX)-containing nucleosomes to form the repair foci. The Ser-721 phosphorylation of BRG1 is critical for binding γ-H2AX-containing nucleosomes and stimulating γ-H2AX formation and DSB repair via increasing the affinity to acetylated H3. While the bromodomain of BRG1, which recognizes acetylated histones, is essential for DSB repair and transcription, the phosphorylation of Ser-721 is dispensable for transcriptional activity. This work establishes BRG1 as a novel and functional ATM substrate and reveals that the ATM-mediated phosphorylation of this chromatin-remodeling enzyme not only modulates DNA repair but also defines the specificity for DNA repair distinct from transcription. In the second part of my thesis, I show that BRG1-BRD increased in various human cancer cell radiosensitivity using clonogenic assay, and that the radiosensitizing activity of BRG1-BRD can be further enhanced by increasing its chromatin binding affinity via dimerization. While little affecting the upstream ATM activation, BRG1-BRD in irradiated HT29 cells inhibited the recruitment of 53BP1 to damaged chromatin, the downstream event of γ-H2AX, and accompanied with inefficient DNA repair, G2/M checkpoint defect and increased apoptosis. In a xenograft mouse model, BRG1-BRD increased the radiosensitivity of HT29 tumors. This work therefore identifies BRG1-BRD as a novel sensitizer for cancer radiotherapy and its action mechanism.;DNA 이중나선절단이 일어나면 매우 조직적인 신호 경로를 거치면서 세포 주기 정지, DNA 복구, 세포사멸이 일어나게 되는데 이를 DNA 손상 반응이라 한다. 방사선 치료는 DNA 손상을 유도하여 암세포를 죽이게 되어 있다. 그러나 암세포의 DNA 복구로 인해 방사선 내성이 일어나고 치료가 잘 되지 않는 경우가 종종 일어난다. 본 실험실의 이전 연구에서 SWI/SNF 크로마틴 리모델링 복합체의 주 인자인 BRG1이 DNA 절단된 위치에서 이중나선절단 복구에 직접적인 역할을 한다는 것을 밝힌 바가 있었다. 그러나 그들의 기능을 조절하는 기작은 대체로 잘 알려지지 않았다. 이번 연구에서 이중나선절단 복구에서 SWI/SNF의 기능을 조절하는 분자적 메커니즘과 암 방사선치료에서의 적용을 조사하였다. 첫 번째에는 DNA 손상 후에 SWI/SNF가 H2AX의 S139 인산화를 활성화시키면서 DSB 복구를 가속화 시킨다는 이전 연구의 조절 메카니즘을 설명하기 위한 것이었다. 먼저 DNA 손상이 일어난 후에 BRG1의 S721이 ATM에 의해 인산화된다는 것을 보았다. 인산화된 BRG1은 gamma-H2AX (H2AX의 인산화 형태)가 포함된 뉴클레오좀과 결합하여 복구 foci 형태를 가지는 것을 확인하였다. BRG1의 S721 인산화는 아세틸화된 H3와 결합을 높임으로써 gamma-H2AX가 포함된 뉴클레오좀과 상호작용을 하고 gamma-H2AX를 활성화하여 DSB 복구를 가속화 시킨다. 아세틸화된 히스톤을 인지하는 BRG1의 브로모도메인은 DSB 복구와 전사에 중요한 반면, S721 인산화는 전사적 활성화에는 불필요하였다. 본 연구에서 BRG1이 ATM의 기능을 가진 새로운 기질임을 밝혔고, 이 크로마틴 리모델링 인자의 인산화는 DSB 복구를 조절할 뿐 아니라 이는 전사와는 별개로 작용하는 것을 밝혔다. 두 번째에는 BRG1의 브로모도메인이 다양한 인간 암세포에서 방사선 민감도를 높이는 것을 밝혔다. 그리고 BRG1의 브로모도메인의 방사선 민감도는 이합체일 때 크로마틴 결합 친화도를 높임으로써 더 많이 증가되었다. ATM 활성화의 상위 경로에는 영향을 거의 미치지 않는 반면, 방사선을 쬔 HT29 세포에서 BRG1의 브로모도메인은 손상된 염색체에 gamma-H2AX의 아래 경로 중 하나인 53BP1이 결집되는 것을 저해시켰다. 그리고 DSB 복구의 저하와 G2/M 정지의 이상, 세포자기사멸(apoptosis)의 증가와 같은 현상들이 동반하였다. 이종이식한 쥐 모델에서도 BRG1의 브로모도메인이 HT29 종양의 방사선 민감도를 증가시키는 것을 확인하였다. 그러므로 본 연구에서는 BRG1의 브로모도메인이 암 방사선치료를 위한 새로운 민감제로 적용할 수 있다는 점과 그것을 설명할 수 있는 기작을 제시하였다.