Activation of NADPH oxidase 4 by Toll-like receptor 5 is essential for atherosclerosis

Abstract

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of blood vessels. It is widely accepted that bacterial infection-mediated inflammation facilitates development of atherosclerosis by activating the toll-like receptor (TLR) signaling system. NADPH oxidases (Nox), which are required for TLR-mediated inflammatory response, are involved in atherogenesis. However, the exact molecular mechanism by which TLR-Nox signaling axis induces inflammation in vascular cells remains to be clarified. In this thesis, I have identified whether activation of Nox isozyme through TLR5 regulates the inflammation in atherogenesis. Since endothelial cells and smooth muscle cells are the representative vascular cells for atherogenesis, I divided the study into two parts and focused on each cells separately. In part I, the thesis show that Toll/Interleukin-1 receptor (TIR) domain of TLR5 interacts with C-terminal region of Nox1 and Nox4. To verify which Nox is involved in reactive oxygen species (ROS) generation in response to flagellin, I purified mouse aortic endothelial cells (MAECs) from wild type, Nox1 knockout (KO) and Nox4 KO mice. Stimulation of Nox1 KO MAEC with flagellin significantly increased ROS generation, but not in Nox4 MAEC. The result strongly suggests that Nox4 activation is required for ROS generation in response to flagellin. ROS regulate pro-inflammatory cytokines including interleukin-8 (IL-8), interleukin-6 (IL-6) and the expression of intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) in mouse aortic endothelial cells (MAECs) and human aortic endothelial cells (HAECs). However, Nox4-deficient endothelial cells attenuated the expressions of IL-8 and ICAM-1, leading to a reduction in the adhesion and trans-endothelial migration of monocytes which are well-known for key events of early atherosclerosis. To evaluate the function of Nox4 in atherosclerosis, ApoE KO or Nox4ApoE double knockout (DKO) mice fed with a high-fat diet (HFD) for 12 weeks were studied. Injection of recombinant FliC (rFliC), which is the active component of flagellin for triggering TLR5 activation, to the ApoE KO mice with HFDs resulted in significantly increased atherosclerotic plaque sizes compared with the saline-injected mice. However, injection of rFliC into the Nox4ApoE DKO mice with HFDs failed to generate atherosclerotic plaque, suggesting that Nox4 deficiency resulted in significant protections against rFliC-mediated atherogenesis. Taken together, I propose that Nox4 activation is critical for the development of the TLR5-dependent atherosclerosis. In part II, I have studied the effect of Nox4 on TLR5-mediated migration of smooth muscle cells (SMCs). Flagellin stimulated ROS generation in SMCs from wild type mice or Nox1 KO mice. However, the ROS generation was significantly reduced in SMCs from Nox4 KO mice in response to flagellin. These results suggest that flagellin induced ROS generation by Nox4 activation in SMCs. To verify that ROS derived from Nox4 activation in response to flagellin regulate stress fiber formation, the F-actin was stained. In wild type SMC, lamellipodium was produced in the leading edge of the cells and lots of dorsal stress fibers and transverse arcs were formed near the leading edge. However, the stress fiber formation attenuated in Nox4 KO SMCs. The result suggests that Nox4 regulates stress fiber formation in response to flagellin. Since stress fiber formation is associated with cell migration, I tested whether Nox4 activation in response to flagellin induces SMC migration. For SMC migration, I performed transwell migration assay and wound healing assay. Flagellin induced SMC migration in wild type mice. However, the migration dramatically decreased in Nox4 KO mice. The results indicate that Nox4 is involved in flagellin-mediated SMC migration. Next, to investigate the role of Nox4 in SMC migration in vivo, I used the carotid artery ligation injury model. rFliC injection significantly induced neointimal hyperplasia in WT mice compared with Nox4 KO mice. Taken together, these results support that TLR5-dependent Nox4 activation is important for SMC migration and neointimal formation. To combine the effect of Nox4 on endothelial dysfunction and SMC migration, I used partial carotid ligation which is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. In this model, rFliC injection significantly induced plaque formation in ApoE KO mice. However, the atheroma formation was significantly decreased in Nox4ApoE double KO mice. SMC were detected in the newly formed atheroma. These results suggest that flagellin-induced endothelial dysfunction and SMC migration synergistically affect atherosclerosis, and Nox4 is an important mediator for this cascade. In conclusion, TLR5-dependent Nox4 activation increases endothelial dysfunction and migration of smooth muscle cells, which are important for atherosclerosis. Hence, I propose that TLR5-dependent Nox4 activation is a potent mechanism underlying inflammation on atherosclerosis. ;동맥경화는 혈관의 가장 안쪽에 과다한 죽종 (atheroma)이 형성되는 질환으로, 혈관벽이 좁아지고 딱딱해지면서 혈류의 순환이 원활하지 않게 되고, 더 나아가 심근경색, 심장마비, 뇌경색으로 이어질 수 있는 위험한 심혈관 질환이다. 고지혈증, 고혈압, 흡연, 당뇨, 과체중, 노화 등이 동맥경화를 일으키는 주된 요인으로 잘 알려져 있으나, 최근 연구들에 의하면, 박테리아 감염에 의한 염증반응이 Toll 유사수용체 (Toll-like receptor, TLR)를 활성화시킴으로써 동맥경화를 유발할 수 있다는 것이 많이 보고되었다. 혈관에서 활성산소 (Reactive oxygen species)를 생성하는 주된 원천인 NADPH oxidase (Nox)는 이러한 Toll 유사수용체를 통한 염증반응에 관여하는 매개체로 작용한다. 그러나 Toll 유사수용체와 NADPH oxidase를 통한 염증반응이 동맥경화를 유발하는 것에 대한 정확한 분자적 기전은 아직 많이 연구되지 않은 상황이다. 특히 Toll 유사수용체 TLR2와 TLR4에 대한 연구는 진행된 바 있으나, TLR5에 대한 연구는 거의 미비하다. 따라서 본 논문에서는, TLR5를 통한 NADPH oxidase의 활성이 염증반응을 통해 동맥경화를 유발하는 분자적 기전을 규명하고자 하였다. 동맥경화를 유발하는데 관련된 대표적인 심혈관 세포는 혈관 내피세포 (endothelial cell)와 평활근 세포(smooth muscle cell)인데, 본 논문에서는 파트 1과 2로 나누어 각 세포에서 일어나는 현상을 확인하였다. 파트1에서는, 우선 다양한 방법을 통하여 TLR5가 어떤 Nox isozyme과 상호작용하는지 확인하였다. 그 결과, TLR5의 Toll/Interleukin-1 receptor (TIR) domain과 Nox1, Nox4의 C-terminal region이 서로 상호작용하고 있음을 알 수 있었다. 그렇다면 TLR5의 리간드 (ligand)인 flagellin을 처리하였을 때, Nox1과 Nox4를 통해 활성산소가 생성되는지 확인하고자, Nox1 결핍마우스과 Nox4 결핍마우스의 혈관내피세포를 분리하여 확인해보았는데, 특이하게도 Nox1 결핍마우스의 내피세포에서는 wild type 마우스의 내피세포와 마찬가지로 활성산소가 생성되었으나, Nox4 결핍마우스의 내피세포에서는 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 사람의 대동맥 내피세포에서 Nox4를 knockdown시켜 다시 한번 확인해보았을 때, 역시 Nox4가 knockdown되면 flagellin에 의해 증가하던 활성산소가 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 flagellin을 통해 TLR5를 활성화 시키게 되면 Nox1이 아닌 Nox4가 활성화 되어 활성산소를 생성한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 활성산소는 IL-8, IL-6 등의 염증반응에 관여하는 사이토카인 (cytokine)의 분비를 촉진시키고, 내피세포표면에 세포간부착분자 (ICAM-1)의 발현을 증가시킴으로써, 단핵백혈구 (monocyte)가 내피세포에 부착하고 내피세포 사이로 이동하는 현상을 유발하였고, Nox4가 Knockdown된 경우에는 이러한 현상이 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다. 단핵백혈구의 내피세포 표면에 부착 (monocyte adhesion) 과 내피세포사이로의 이동 (trans-endothelial migration)은 동맥경화를 유발하는 초기 단계에 중요한 현상이기 때문에, 최종적으로 이러한 현상들이 동맥경화 생성에도 연결되는지 알아보고자 하였다. ApoE 결핍마우스는 혈액내의 콜레스테롤을 간으로 이동시키지 못하여 혈중 콜레스테롤 수치가 높아져 동맥경화가 더 잘 일어나는 마우스이다. 이러한 ApoE 결 마우스와 Nox4를 유전적으로 결핍시킨 Nox4ApoE 이중결핍 마우스에 flagellin을 주기적으로 주입하고, 고콜레스테롤 식이를 먹임으로써 12주간 장기적 염증반응을 통한 동맥경화를 유발시켰는데, 그 결과, ApoE 결핍마우스에서 flagellin에 의해 동맥경화현상이 더 증가하였고, Nox4ApoE 이중결핍 마우스에서는 그러한 현상이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여볼 때, TLR5에 의한 Nox4의 활성화로 생성되는 활성산소가 다양한 염증반응 매개체를 생성시키고 결과적으로 동맥경화를 유도한다는 사실을 알 수 있다. 파트2에서는 평활근세포에서 일어나는 현상을 연구하였다. 앞서 파트1에서 확인한 것처럼 TLR5는 Nox1과 Nox4와 상호작용하고 있기 때문에, 평활근세포에서는 어떤 Nox isozyme이 활성산소 생성에 관여하는지 확인하고자 Nox1, Nox4 결핍마우스의 평활근세포를 분리하여 flagellin을 처리하였을 때 생성되는 활성산소를 측정해보았다. 그 결과 Nox4가 결핍된 쥐의 평활근세포에서 flagellin에 의한 활성산소가 현저히 감소하는 것을 확인하였고, 이를 통해, 내피세포에서와 마찬가지로 flagellin에 의한 TLR5의 활성은 Nox1이 아닌 Nox4를 경유하여 활성산소를 생성한다는 것을 알 수 있었다. 다음으로 이러한 활성산소의 생성이 평활근세포의 이동을 유발할 수 있는지 확인해보았는데, flagellin 자극이 주어질 때, wild type 마우스의 평활근세포 움직임이 크게 증가한 반면, Nox4 결핍 마우스의 평활근세포에서는 그 정도가 큰 폭으로 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 세포에서의 현상이 생체 내에서도 이루어지는지 확인하고자, 마우스의 왼쪽 경동맥을 묶어 신생내막증식 (neointimal hyperplasia)을 유도하는 모델을 이용하였다. Wild type 마우스의 경동맥을 묶고, flagellin을 주입하게 되면 flagellin을 주입하기 전에 비해 현저하게 신생내막증식 현상이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, Nox4 결핍 마우스의 경동맥을 묶고 flagellin을 주입하게 되면 wild type 마우스의 경우보다 크게 그 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들은 TLR5에 의한 Nox4의 활성이 평활근 세포의 이동과 신생내막증식에 중요하게 관여한다는 것을 뒷받침해준다. 결론적으로, TLR5에 의한 Nox4의 활성은 혈관내피세포의 기능장애와 평활근세포의 이동을 증가시킴으로써, 최종적으로 동맥경화를 유발한다고 볼 수 있으며, 더 나아가 이러한 기전은 동맥경화를 위한 치료전략으로 적용될 수 있을 것이다.