Rapid pretreatment method suitable for bacterial gene analysis via qPCR

Abstract

In this study, simple physical approach for effective cell lysis of bacteria was evaluated in sand samples. Bead beating method was tested for Pseudomonas putida seeded sands without purification. The lysates from the method was subject to further qPCR assay as compared to the commercial DNA extraction kit. Attempt defining the criteria of relatively clean environmental samples is also presented by investigating the effects of PCR inhibitors. The bead beating with 0.1 mm glass beads at 3000 rpm for 3 minutes showed the best lysis performance. The lysates from bead beating showed the better performance than that of commercial DNA extraction kit. Further experiments with PCR inhibitors (humic acids, clay, and magnesium) showed that the sands containing less than 10 μg/g of humic acids and 70% of clay are sufficiently applicable for this simple cell lysis prior to the qPCR assay. Interestingly, the inhibition pattern of magnesium was different from the others due to the complexation interaction of magnesium with DNA fragments. Careful caution should be practiced for working with magnesium (or mineral) rich soils.;미생물의 유전자(gene)를 단순히 검출하는 것을 넘어 이들을 정성 및 정량적 분석을 가능케 하는 분자학적 기술들이 발달됨에 따라 환경 시료로부터 보다 정확하고 양질의 결과를 얻을 수 있게 되었다. 환경 시료로부터 추출한 미생물의 유전자 즉, DNA는 이러한 분석법의 주요 대상으로써 분석 결과에 직접적인 영향을 미치는 중요한 요인들 중 하나이다. 그러나 토양 시료의 경우 이질성(heterogeneity)과 복잡성(complexity)이 큰 특징을 가진다는 점에서 이들로부터 유전물질(DNA)를 얻는 것이 매우 어려우며 그 과정 또한 복잡하다. 따라서 다양한 종류의 토양 시료로부터 미생물의 유전물질(DNA)을 추출하기 위한 효과적인 전처리 방법에 대한 연구가 진행되어 왔다. 토양 시료의 특성에 맞게 시중에 판매되고 있는 DNA 추출 키트를 사용하는 방법이 가장 일반적이지만 넓은 스펙트럼의 시료를 모두 아우를 수 없다는 점과 키트 자체가 갖는 여러 단점들이 보고됨에 따라 이를 대체할 수 있는 적절한 전처리 방법에 대한 필요성이 제기되고 있다. 따라서, 본 논문에서는 물리적 세포 용해(physical lysis) 방법만을 적용하여 정제(purification)단계를 생략하고 모래(sand) 시료 속의 박테리아로부터 보다 빠르고 간편하게 유전물질(DNA)을 얻을 수 있는 전처리 방법에 대하여 연구하였다. 본 연구에서는 물리적 세포 전처리 방법 중의 하나로 유리 비드 (glass beads)를 이용한 비드 분쇄법(bead beating disruption)을 채택하였으며, 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 종이 접종된 모래(sand) 시료를 이용하였다. 먼저, 비드 분쇄법을 적용하기 위한 적합한 비드의 종류와 이를 처리하는 속도 및 시간을 결정한 결과 직경 0.1 mm 크기의 비드 만을 사용하여 3000 rpm의 속도로 3분 이내로 처리하였을 때 lysis 효율이 가장 빨리 90%에 도달하였다. 따라서 이후의 실험들에서도 이와 같은 조건을 이용하여 진행하였다. 뿐만 아니라 기존에 사용되고 있는 DNA 추출 키트와 비교를 통하여 이러한 bead beating 방법의 실질적인 적용 가능성을 평가하였다. 이를 평가하는 방법으로는 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR, quantifying polymerase chain reaction) 분석법을 채택하였다. 그 결과 비드 분쇄법으로 처리한 경우에 비해 기존 키트의 경우 40%에 해당하는 정량화 결과를 보였다. 따라서, 비드 분쇄법을 사용하는 것이 전처리에 소비되는 시간과 비용은 절감하면서 정량화의 효율은 높 일 수 있다는 결론을 얻을 수 있었다. 마지막으로, sand 시료 속에 다양한 저해제(inhibitor)가 존재할 경우 위 방법을 적용할 수 있는 실질적인 적용 범위를 제시하였다. 휴믹산(Humic acid)과 점토질 토양(clay)이 각각 모래(sand)와 혼재한 조건에서 휴믹산은 10 μg/g 이내일 때, 점토질 토양의 경우 70% 함량 이내일 때 특별한 purification 없이 물리적인 전처리 방법인 비드 분쇄법 만으로도 qPCR 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다. 마그네슘 이온의 경우 고농도일 때 오히려 기존의 키트보다 더 뛰어난 정량 결과를 보였다. 결과적으로 비드 분쇄법 만을 적용한 전처리 방법의 경우 극단적인 이화학적 특성의 시료가 아니라면 본 연구에서 제시한 범위 내에서는 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 위한 전처리 방법으로 그 사용이 가능 할 것으로 보여졌다. 그러나 이러한 저해제(inhibitor)들의 복합적인 저해 기작에 대하여 추가적으로 살펴볼 필요가 있으며 자연상에 존재하는 실제 토양 시료에 대한 실질적 적용 및 평가가 필요할 것으로 보인다. 이는 실제 토양의 경우 훨씬 더 복잡하고 복합적인 영향이 있을 수 있기 때문이며 이러한 시료에 적용하고자 할 경우 그 특성에 관한 적절한 판단을 통하여 해당 시료에 적합한 전처리 방법을 선택해야 할 것이다.