Plasmid PTEN transfection on adipose-derived stem cells for functionality enhancement

Abstract

줄기세포를 이용한 치료법은 광범위한 세포, 조직, 심지어 장기의 치료에까지 적용될 수 있다. 지방유래 줄기 세포는 다량 추출이 가능하다는 점과 치료 적용시 자가지방을 이용하게 됨으로써 면역반응을 줄일 수 있고, 다양한 세포로 분화가 가능하다. 하지만 충분한 양을 획득하기 위해 생체 밖에서 계대배양을 해야하는데, 이를 지속할 경우 줄기세포의 노화로 인해 줄기세포능을 잃는 어려움이 있다. 이러한 어려움을 개선시키기 위한 방안으로, 세포노화에 관여하는 것으로 알려진 Akt를 저해하는 PTEN 유전자를 선정하였다. PTEN 유전자를 지방 유래 성체줄기세포에 유전자치료는 지속적인 단백질 방출이 가능하기 때문에 한 번의 투여로 지속적인 치료효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 줄기세포의 노화를 방지하면서 이러한 효과를 지속적으로 유지시켜줄 수 있는 방법으로 PTEN 유전자를 지방유래 줄기세포 내로 PTD를 이용하여 도입시키는 방법을 선택하였다. PTEN 유전자가 계대배양 이 후에 남아있음을 확인하기 위해 western blot 법을 이용하여 PTEN 띠를 확인하였다. PTEN의 노화방지 효과를 확인하기 위해 노화지표인 β-galactosidase를 염색하여 확인하였고, 모양이 노화된 세포에 비해 표면적이 작고 팔길이 짧음을 확인하였다. 또한 세포독성을 확인하기 위해 유효농도보다 10배 이상 강한 PTEN을 처리한 결과, 처리하지 않은 군과 세포생존력이 거의 비슷한 것으로 보아 독성이 없는 것을 확인하였다. 이를 통해 PTEN이 지방유래 줄기세포를 이용한 치료를 함에 있어서 그의 노화 방지에 탁월한 효과가 있음을 증명하였다.;To prevent a stem cell from aging after several generation of ex-vivo cultivations, phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome ten(PTEN) gene was used. PTEN gene is a phosphatase in the phosphatidylinositol kinase(PI3K)-mediated-pathway. PTEN is known to inhibit the activation of AKT, known as one of the senescence factors. The PTEN gene was transfected to adipose-derived stem cells(ASCs) instead of protein for extended term of efficacy and prolonged secretion of bioactive protein for stem cell therapy. To determine the PTEN gene maintenance over the series of culturing, ASC of low passage was transfected and the PTEN level was examined over the long-term cultivation with western blotting. The results showed that PTEN was expressed over 5 passages. ASCs transfected with PTEN gene showed less signs of senescence. For instance, the morphologies of ASCs without PTEN were more flat and enlarged. Also, the activity of telomerase, which is an telomere repairing enzyme, was measured through real-time PCR and showed highter activity in ASCs transfected with PTEN almost twice more the negative control group. These results demonstrate that PTEN might inhibit the senescence of ASCs.