Functional characterization of Klf5, a gene downstream to Foxa2, in mammalian neural precursor cells

Abstract

Midbrain dopamine (DA) neurons regulate voluntary movement, addiction, attention and rewards based behaviors. The role of transcription factors in controlling the development of DA neurons has been intensively studied because the dysfunction or degeneration of these cells can lead to neurological disorders including Parkinson’s disease. Included among the transcription factors are Foxa2 and Nurr1 whose involvement in DA neurons development has been demonstrated. Foxa2, a member of the Foxa family of winged helix/forkhead family, cooperates with Nurr1 to induce midbrain-specific gene expression, the acquirement of DA phenotypes, and neuronal maturation. However, the direct and positive determinants of midbrain DA neurons regulated by Foxa2 have remained unclear. In this paper, I found large number direct or indirect target genes of Foxa2 by using microarray analysis. I further validated that Foxa2 directly regulated Klf5 expression by performing chromatin immunoprecipitation assay. Foxa2 and Klf5 mRNA expression overlap in ventral midbrain progenitors of mouse embryos, and both proteins are also expressed in floor plate of ventral midbrain at E 12.5. In neural precursor cells (NPCs), Klf5 cannot induce midbrain Th positive DA neurons in combination with Nurr1. These results suggest that Klf5 is not sufficient for differentiation of midbrain DA neurons in replacement of Foxa2. Although Klf5 cannot replace the function of Foxa2 in NPCs, I show the role of Klf5 in murine NPCs that Klf5 control the expression of several genes such as Ednra, Lox and Sloco4a1.;도파민 신경세포(Dopaminergic neurons)는 중추 신경계에서 도파민을 신경 전달 물질로 분비하는 세포로서 행동과 인식, 감정, 자발적 움직임 등을 조절하는 다양한 기능을 갖고 있다. 이들은 중뇌의 흑색질 (SNc)과 복측피개부 (VTA)에 많은 수가 존재하며, 이 부위의 도파민 신경세포가 아직 확실히 알려지지 않은 원인에 의해 선택적, 지속적 파괴 및 기능 손실이 나타나게 되면, 파킨슨 병과 같은 신경계 질환이 발생하게 된다. 따라서, 현재 이러한 중추 신경계 질환의 근본적인 치료법을 개발하기 위해, 도파민 신경세포의 발달을 조절하는 전사인자에 대한 연구가 지속적으로 이루어 지고 있다. Foxa2는 초기 신경 발달 과정 중 중뇌 도파민 신경세포 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 전사인자이다. 이들은 도파민 신경 전구세포에서 특이적으로 나타나는 여러 인자들의 발현을 조절함으로써, 도파민 신경세포의 성숙과 분화에 관여한다. 이 논문에서는 mouse 신경 전구세포에서 Foxa2의 기능을 좀 더 알아보고자 이들에 의해 직접적으로 조절되는 유전자를 동정해 보았다. 먼저 microarray analysis 를 통해, 신경 전구세포에서Foxa2 과발현에 따른 유전자 발현 정도의 차이를 분석하여 28개의 Foxa2 target 후보 유전자를 찾고, ChIP-Seq을 이용한 선행 연구 결과와 비교 분석하여 최종 5개의 target 유전자 (Shh, Calca, Ednra, Klf5, Cmtm8)를 선별하였다. 이들 중 Klf5는 mouse배아의 복측 중뇌부위에서 발현되며, 이는Foxa2의 발현 양상과 유사함을 확인 할 수 있었다. 다음으로, ChIP assay를 통해, Klf5의 promoter 부분에서 Foxa2가 직접적으로 결합한다는 증거를 찾고, 이 부분의 종간 보존이 잘 되어있는 Foxa2 binding site들을 확인 함으로써, Klf5가 Foxa2의 직접적인 조절을 받는 유전자라는 증거를 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, 도파민 신경세포 발달과정 중 Klf5가 Foxa2의 기능을 대신할 수 있을 거라는 가설을 세우고, Klf5와 Nurr1을 동시에 과발현 시켜 신경 전구세포의 분화를 유도하였다. 그 결과, Klf5는 도파민 신경세포를 성숙, 분화시키는 데에 충분한 조건이 아님을 알 수 있었다. 비록 Foxa2를 대체할 수 있을 만한 기능을 갖고 있진 않지만, Klf5 과발현과 Knockdown실험을 통해, 이들에 의해 발현이 조절되는 3가지 유전자 (Ednra, Lox, Sloco4a1)를 동정할 수 있었다.