High fat diet induces inactivation of Prx I through hyperoxidation in adipose tissue, which can be reversed by Nrf2-dependent Sulfiredoxin induction

Abstract

Obesity is known to be closely related to metabolic syndrome and when obese, oxidative stress increases. In particular, only in adipose tissue showed the most potent determinant for systemic ROS in human subjects among various metabolic and body shape parameters. The results demonstrated that ROS is more produced in fat accumulation, which may result in the development of metabolic syndrome. However, the mechanism by which fat accumulation leads to expression and role of antioxidant have not been fully elucidated. In the present report, we show that high fat diet (HFD) in mice was found to markedly increase the abundance of sulfiredoxin (Srx) and peroxiredoxin I (Prx) expression in adipose tissue. Analysis of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf)-deficient mice indicated that the HFD-induced up regulation of Srx and Prx I expression is mediated mainly via a pathway dependent on the transcription factor Nrf2. Srx regenerated hyperoxidized Prxs. This reduction of sulfinic acid by Srx is specific to 2-Cys Prxs. Therefore, regulation of Prx functions is dependent on a sulfinyl reductase referred to as Srx. To gain further insight into the role of Srx in obesity, we used Srx-deficient mice. In particular, most of Prx I was found to be hyperoxidized in adipose tissue of mice fed HFD, with this effect being markedly enhanced in Srx-deficient mice. These observations suggested that Prx I is the most active 2-Cys Prx in elimination of ROS in adipose tissue of mice fed HFD. Fraction of adipose tissue showed that Prx I, but not of Prx II, is located on the ER, where Nox4 is located. In addition to inducing the expression of Srx in adipose tissue, HFD elicited the translocation of Srx to ER. In addition, we demonstrated that HFD also increases the abundance of Nox4, a major contributor to obesity-induced ROS production in adipose, and the production of ROS on the ER. Nox4 is known to generate ROS as NADPH oxidase (Nox) in adipose tissue. We also found high expression of Nox4 was significantly increased rather than Nox1 and Nox2 in adipose tissue of diet-induced mice. Importantly, the oxidative stress was also attenuated in adipose tissue of Nox4-deficient mice fed HFD. In parallel with this finding, Nox4-deficient mice fed HFD exhibited anti-obese phenotype. These results suggest that Nox4 is elevated and contributes to ROS production in accumulated fat. In contrast, obesity was exacerbated by ablation of Srx and Prx I. In parallel with this finding, oxidative injury, as revealed by the formation of 4-HNE and 3-NT adducts, was more severed in adipose tissue of Srx and Prx I-deficient mice fed HFD. Finally, obesity is strongly associated with apoptotic adipocyte. We also found that, apoptotic adipocyte exacerbated by ablation of Srx and Prx I mice fed HFD compared with wild type mice. Taken together, our results suggest that expression of antioxidant, in particular Srx and Prx I, correlated with obesity-induced oxidative stress. Maintenance of a balanced redox state within adipose tissue is of critical importance to a wide variety of biological systems. ;비만은 음식물의 섭취와 에너지 사용간의 불균형에 의해 초래되는 질병으로, 제2형 당뇨병 및 동맥경화증 등 심각한 질병을 동반할 수 있다. 최근에는 비만, 당뇨, 고지혈증, 고혈압 등을 묶어 대사증후군으로 부르게 되었으며, 그 어느 때 보다 전세계 적으로 비만에 대한 관심이 집중되고 있다. 이러한 비만은 지방 조직이 과다 축적되는 것으로 과거에는 단순히 지방을 축적하는 기관으로 인식되어 왔으나 최근의 연구를 통해 여러 가지 호르몬을 분비하는 내분비 기관이기도 하며, 인체 대사에서 대단히 능동적으로 작용하여 에너지 항상성을 유지하는 장기라는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 섭취한 영양소는 중성지방 형태로 지방 조직에 축적되며, 비만은 지방세포의 비대 (hypertrophy)와 과형성 (hyperplasia)으로 초래된다. 또한 최근 여러 연구에서 비만 동물모델과 환자에서 활성산소가 증가되어 있음이 밝혀졌고 특히 지방세포 에서만 활성산소가 특이적으로 증가함을 증명하였다. 이런 활성산소에 의한 산화 스트레스가 비만 환자에서 여러 합병증의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 비만으로 인한 활성산소로부터의 세포 또는 조직의 손상은 당뇨, 염증, 노화, 종양 생성 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 즉 활성산소의 과다한 생성과 이에 대한 세포 내의 적절한 방어 기전에 문제가 생길 경우, 이것이 여러 질환에 직•간접적으로 관여할 것이라 생각된다. 그러므로 세포는 활성산소의 항상성을 유지하려고 각종 항산화효소 생산체계를 갖추고 있다. 그러나 활성산소의 생성이 과도하거나 또는 항산화효소가 정상적으로 작동하지 않으면 이들간의 균형이 무너지는데 이러한 상태를 산화 스트레스라고 부른다. 현재까지의 연구들을 통해 비만으로 인해 지방조직에서 활성산소가 생성된다는 것은 인식하고 있으나 이러한 활성산소를 제거하는 항산화효소가 비만에서 어떠한 역할을 하는지에 대한 연구는 아직까지 미비한 상태이다. 그리하여 본 논문에서는 비만에 의한 지방세포에서 항산화효소의 발현과 특정 항산화효소의 결손을 통해 비만에 어떠한 영향을 미치는 지와 마지막으로 어떠한 효소에 의해 비만으로 인한 활성산소가 생성되는지를 밝히는 연구들을 수행하였다. 먼저 비만 동물모델을 만들기 위해 마우스에 고지방 식이를 12주 동안 실시하였다. 그 결과 지방조직에서 고지방 식이에 의해 12주에서 19주까지 항산화효소인 Srx와 Prx I이 과발현 됨을 단백질과 mRNA 분석을 통해 보여주었다. 항상화효소의 증가는 고지방 식이로 인해 지방조직에서 활성산소가 생성되었다는 반증이며 이러한 Srx의 증가는 활성산소에 의해 불활성화된 Prx을 되돌려 주며 여러 가지 독성으로부터 조직을 보호하는데 기여할 것이다. 이러한 단백질 발현을 유발하는 기전을 규명하기 위해 항산화 연구에 널리 이용되며 산화 스트레스 하에서 여러 항산화효소를 발현시킬 수 있는 중요한 transcription factor인 Nrf2 signaling pathway에 초점을 맞추어 실험하였다. 본 연구에서는 이러한 Nrf2가 결손 된 유전자 적중 동물 모델을 이용하여 고지방 식이를 일정기간 실시하였다. 그 결과 wild type에서는 고지방 식이에 의해 Srx와 Prx I이 과발현 하였으나 Nrf2 결손 마우스에서는 이러한 단백질 발현을 볼 수 가 없었다. 즉 고지방 식이에 의한 Srx와 Prx I 발현 증가는 Nrf2 signaling pathway를 통해 발현됨을 증명하였다. 고지방 식이에 반응하여 지방조직에서 과발현 되는 Srx의 역할 규명을 위해 Srx가 결손 된 마우스를 이용하여 고지방 식이를 Nrf2 마우스와 동일하게 12주 동안 실시하였다. 그 결과 wild type에서 Srx와 Prx I이 발현 되었으며 Srx가 결손 된 마우스 에서는 고지방 식이에 의해 Prx I이 크게 과산화 됨을 immunoblot과 2-Diemsional gel electrophoresis 분석을 통해 각각 증명하였다. 이러한 결과는 비만에 기인한 활성산소에 의해 불활성화된 Prx I이 Srx가 결여됨으로써 환원되지 못했음을 증명한 것이다. 그리고 이러한 Prx I은 지방조직에서 cytosol과 ER에 분포함을 지방조직 분획을 통해 보여주었다. 또한 Srx가 결손 된 마우스의 지방조직을 cytosol과 ER로 분획한 결과 Srx-wild type에서 고지방 식이에 의해 Srx가 cytosol에서 ER로 전이됨을 확인하였으며 Prx I역시 cytosol보다 ER에서 고지방 식이에 의해 크게 발현됨을 immunoblot 분석을 통해 보여주었다. 여기에서 무엇보다 중요한 점은 Srx가 결손 된 마우스의 지방조직에서 고지방 식이에 의해 불활성화된 Prx I이 ER에서 과산화 된다는 것이다. 즉 ER에 위치하는 Prx I이 고지방 식이에 의한 활성산소에 의해 불활성화 되는 것이다. 최근 연구에 따르면 비만 동물모델의 지방조직에서 NADPH oxidase (Nox)의 구성요소들이 증가함을 보고하였으며 Noxs는 산소로부터 전자 하나를 빼앗아 전자의 제공자로 NADPH를 사용해 superoxide를 만든다. 이러한 Noxs는 활성화를 위한 다양한 활성체와 소단위의 종류에 따라 Nox1~5, Duox1~2로 분류된다. 하지만 고지방 식이에 의해 Prx I의 과산화를 유발하는 활성산소 유발 효소 중에서 Nox4만이 지방조직에 존재하면서 고지방 식이에 의해 자극 된다는 것이 기존의 논문들을 통해 증명되었으며 더욱 중요한 점은 Nox4가 Prx I과 같이 ER에 위치한다는 것이다. 이러한 기존의 결과들을 토대로 Nox4가 결손 된 마우스를 이용하여 고지방 식이를 12주 동안 실시하였다. 그 결과 wild type에서는 고지방 식이에 의해 Srx와 Prx I이 과발현 되었으나 Nox4-결손 마우스에서는 이러한 단백질 발현을 볼 수 없었다. 더욱 Nox4-결손 마우스의 지방조직에서 산화 스트레스가 wild type에 비해 감소함을 3-NT와 4-HNE immunohistochemical 분석을 통해 보여주었다. 그에 반해 Srx와 Prx I이 결여된 마우스의 지방조직에서는 고지방 식이에 의해 3-NT와 4-HNE이 wild type에 비해 더욱 진하게 염색됨을 확인할 수 있었다. 즉 이를 통해 고지방 식이에 의해 유도되는 산화 스트레스는 ER에 존재하는 Nox4에 의한 활성산소에 의해 유발됨을 여러 실험을 통해 각각 증명하였다. 또 다른 실험으로 비만은 지방세포의 비대로 인해 macrophage가 침투되어 세포사멸이 유도된다고 알려져 있다. 마우스에 고지방 식이를 실시한 후 표현형을 분석한 결과 Srx이 결손 된 마우스에서 wild type에 비해 체중이 증가하며 지방조직의 무게 역시 증가함을 보여주었다. 그 결과 비만에 의해 유도되는 세포사멸 역시 Srx이 결손 된 마우스의 지방조직에서 더 증가함을 TUNEL staining을 통해 보여주었다. 그에 반해 Nox4-결여 마우스에서는 wild type에 비해 세포사멸이 감소함을 확인하였으며 이와 유의성 있게 Nox4-결여 마우스에서 고지방 식이에 의해 wild type 보다 체중 증가가 적음을 보여주었고 지방조직 무게 역시 wild type 에 비해 증가 폭이 좁음을 확인하였다. 그리고 직접적으로 활성산소를 제거하는 역할을 하는 Prx I이 결여된 마우스에서는 이러한 산화 스트레스와 세포사멸 등이 모두 증가되어 있음을 확인하였다. 마지막으로 최근 연구에 따르면 비만 동물 모델과 환자의 지방세포에서 ER stress가 심화된다는 보고를 토대로 실험한 결과 Prx I이 결여된 마우스의 지방조직에서 고지방 식이에 의해 ER stress가 심화됨을 immunoblot과 mRNA 분석을 통해 확인하였다. 위와 같은 결과들을 종합하여 비만에 기인한 산화 스트레스와 항산화효소인 Srx와 Prx I의 발현이 연관성을 지니고 있음을 알 수 있고 지방세포내의 “redox state”의 균형을 유지하는 것이 활성산소로부터 많은 조직 세포들을 보호하는데 중요함을 보여주었다. 이에 더 나아가 Srx와 Prx I의 발현이 비만으로 인한 산화 스트레스와 관련된 손상을 줄일 수 있는 새로운 방법이 될 수 있다고 생각하며 이것이 비만과 연관된 질병의 잠재적인 표적약물이 될 수 있을 것이라 제시한다.