Regulation of MRP4 mediated drug transport by NHERF3/PDZK1 in kidney

Abstract

Na+/H+ exchanger regulatory factor 3 (NHERF3/PDZK1) is a PSD-95/discs large/ZO-1 (PDZ)-based adaptor that has been suggested to regulate several membrane transporting proteins in epithelia. However, the in vivo physiological role of NHERF3 in transepithelial transport remains poorly understood. Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is an ATP-binding cassette transporter that mediates the efflux of organic molecules, such as nucleoside analogues, in the gastrointestinal and renal epithelia. In this study, we report that Nherf3-knockout (Nherf3-/-) mice exhibit profound reductions in Mrp4 expression and Mrp4-mediated drug transport in the kidney. A search for the binding partners of the carboxy-terminal PDZ-binding motif of MRP4 indicated that MRP4 most strongly associated with NHERF3 among several epithelial PDZ proteins. When expressed in HEK 293 cells, NHERF3 increased membrane expression of MRP4 by reducing internalization of cell surface MRP4 and consequently augmented MRP4-mediated efflux of adefovir, a nucleoside-based antiviral agent and well-known substrate of MRP4. Examination of wild type and Nherf3-/- mice revealed that Nherf3 is most abundantly expressed in the kidney and shows a prominent role in modulating Mrp4 levels. Deletion of Nherf3 in mice induced a profound reduction in Mrp4 expression at renal proximal tubules and evoked a significant increase in the plasma concentration and kidney concentrations of adefovir, with a corresponding decrease in the systemic clearance of adefovir. These results suggest that NHERF3 is a key regulator of organic transport in the kidney, particularly for MRP4-mediated clearance of drug molecules.;PDZ단백은 상피 조직과 신경 조직에 존재하며, 단백-단백 결합을 통해 세포막에 존재하는 수용체, 수송체 및 통로 등의 발현과 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. NHERF3/PDZK1은 4개의 PDZ도메인으로 구성된 PDZ단백으로 소화기와 신장의 상피세포에 많이 존재하며 다양한 막단백들과 결합하여 이들을 조절함이 보고 되어 있다. 하지만 Nherf3 유전자를 제거한 쥐를 관찰한 결과 특이적으로 드러나는 결함이 발견되지 않았으며, NHERF3의 생리적인 역할이 아직 불분명함을 알 수 있다. MRP4는 ATP를 에너지로 이용하여 기질을 세포안에서 밖으로 수송하는 ABC family에 속하는 막 수송체로, 내인성 물질뿐 아니라 약물 및 약물 대사체의 수송에 중요한 역할을 한다. MRP4는 신장 상피세포에 많이 존재하며, 기질이 되는 다양한 항바이러스제제, 항암제, 면역억제제 등의 배설과 독성에 관련이 있음이 보고되었다. MRP4는 구조적으로 C 말단에 PDZ 도메인과 결합할 수 있는 특이적인 모티프를 가지고 있으며 이는 MRP4의 조절인자로서 PDZ 단백이 관여할 것임을 추측할 수 있다. 본 연구에서는 MRP4의 조절인자를 스크리닝하는 과정에서 NHERF3가 가장 강력하게 결합함을 확인하였고, MRP4의 C 최말단이 NHERF3의 첫번째 PDZ 도메인과 직접적으로 결합함을 밝혔다. 이 결합으로 인하여 MRP4의 수송 기능이 증가하였고, 또한 MRP4의 세포막 발현 및 세포내 총 단백량을 증가하였다. 이는 NHERF3가 세포막으로부터 MRP4의 세포내로의 이동을 저해하여, 세포막에서의 안정성을 증가시키기 때문임을 밝혔다. 또한 세포내로의 이동이 저해됨에 따라 이후 일어나는 라이소좀으로의 단백 분해 경로도 저해됨을 보였고, 이는 NHERF3에 의해MRP4의 세포내 총 단백량도 증가함과 연관된다. 위의 in vitro 실험결과가 in vivo에서도 재현되는지를 확인하기 위해 정상 쥐와 Nherf3-knockout mice에서의Nherf3와 Mrp4의 발현을 확인하였다. Nherf3는 신장 조직에서 두드러지게 발현하며, 정상 쥐에 비해 Nherf3-knockout mice의 신장 조직에서 Mrp4의 발현이 현저하게 저해됨을 확인하였다. Nherf3의 부재로 인한 Mrp4의 발현감소가 실제 생리적으로 미치는 영향을 알아보기 위해, 항바이러스 제제이며 MRP4의 기질인 adefovir를 정상 쥐와 Nherf3-knockout mice에 각각 정맥 주입하였다. Adefovir는 대사를 거치지 않고 대부분 신배설 하는 약물로서, 신장 세포에서의 소실에 MRP4가 역할을 하는 것이 잘 알려져 있다. 정상 쥐에 비해 Nherf3-knockout mice에서 adefovir의 혈중 농도가 증가하였고, 배설이 감소되었다. 또한 Nherf3-knockout mice의 신장조직내의 adefovir의 농도가 증가하였고, 이는 adefovir의 부작용인 용량의존적인 신독성을 야기할 수 있음을 제시한다. 이상의 연구를 종합하여 볼 때, NHERF3는 MRP4와 직접적인 PDZ 결합을 통해 MRP4의 발현 및 기능을 조절하고, 이는 생리적으로 MRP4의 기질이 되는 약물의 약동학에 영향을 준다. 특히 두 단백이 두드러지게 발현되는 신장에서 NHERF3의 MRP4에 대한 조절이 중요시되며, 이는 NHERF3가 MRP4에 의해 수송되는 약물의 분포와 배설에 중요한 조절인자임의 가능성을 제시한다.