Arthrobacter simplex에서 유도물질에 따라 생성되는 Steroid △¹-dehydrogenase의 특성 연구

Abstract

Steroid Δ^(1)-dehydrogenase는 9α-hydroxylase와 함께 미생물에서 steroid 핵 개환에 중요한 효소이다. 그러므로 steroid Δ^(1)-dehydrogenase steroid를 탄소원으로 이용하는 steroid 분해 균주에서는 필수적인 효소이다. 본 실험에서는 steroid 분해 균주인 Arthrobacter simplex를 이용하여 steroid의 측쇄 길이가 긴 cholesterol과 측쇄 길이가 짧은 hydrocortisone을 유도 물질로 유도시 생성되는 Δ^(1)-dehydrogenase를 각각 비교하고 이 효소의 기질 특이성에 따라 효소의 성질을 알아보았다. Δ^(1)-dehydrogenase를 분리 정제하기 위해 각각 cholsterol과 hydrocortisone을 유도 물질로 배양했을때 Δ^(1)-dehydrogenase의 활성이 가장 높은 배양 시간은 16시간이었다. 배양한 다량의 균체를 준비하여 glass bead-beater를 이용해 세포를 파쇄한 후, 100,000xg에서 90분간 초원심분리하여 cell debris를 제거하고 남은 상등액을 조효소액으로 하였다. streptomycin sulfate로 핵산을 제거하였고 DEAE-cellulose, Gel filtration, Testosterone agarose 등의 column chromatography를 수행하여 효소 정제를 시도하였다. 각각 유도된 Δ^(1)-dehydrogenase들은 DEAE-cellulose, Gel filtration column 상에서 같은 양상으로 부분정제되었다. 특히 Gel filtration 결과, 분자량이 큰 활성 분획과 작은 활성 분획의 두 부분을 볼 수 있다. 분획들을 4℃에서 polyacrylamide gel electrophoresis 한 후, gel 상에서 Δ^(1)-dehydrogenase의 위치를 찾기위해 oxido-reductase 검색용 염색 (Heeb et al.) 결과, 분자량이 큰 활성 분획의 효소는 분자량이 98,000으로, 분자량이 작은 활성 분획에서는 28,000으로 추정되었다. 이 결과 각각 다른 유도 물질들에 의해 생성된 Δ^(1)-dehydrogenase들은 분자량이 98,000과 28,000인 같은 효소들을 유도한다고 할 수 있었다. Δ^(1)-dehydrogenase의 기질 특이성 조사에서 분자량이 98,000과 28,000인 두 효소는 모두 3-keto steroid에 기질 특이성을 보이나, 특히 cholestenone과 같은 측쇄 길이가 긴 steroid는 분자량이 98,000인 효소에 높은 기질 특이성을 보여 주며, hydrocortisone과 androstenedione과 같은 측쇄 길이가 짧은 steroid는 분자량이 28,000인 효소에 높은 기질 특이성을 보여준다. 또한 이 두 효소의 균체내 분포에 대한 실험에서, hydrocortisone과 cholesterol로 유도시킨 균체를 파쇄하여 초원심분리한 후 상등액 분획과 침전 분획으로 분리하여 cholestenone과 hydrocortisone을 기질로 사용하여 활성을 측정하였다. cholestenone은 침전 분획에서 기질 특이성이 높았고 hydrecortisone은 상등액 분획에서 높은 기질 특이성을 보여 주었다. 그러므로 분자량이 98,000인 효소는 침전 분획에 존재하고, 28,000인 효소는 상등액 분획에 많이 분포하리라 추측된다. 또한 Δ^(1)-dehydrogenase의 촉매적 특성에 관한 연구에서 분자량이 98,000인 효소와 분자량이 98,000인 효소의 최적 pH는 각각 PH 8과 pH 9부근으로 나타났다.;Steroid Δ^(1)-dehydrogenage is supposed to be related with the cleavage df steroid nucleus degradation which is important process in microorganism using steroid as the carbon source. Research objectives are comparison with the steroid Δ^(1)-dehydrogenase s induced by hydrcortisone and induced by cholesterol and addition to that, the characterization of the steroid Δ^(1)-dehydmgenage by the substrate specificities. Steroid Δ^(1)-dehydrogenages induced by hydrocortisone and induced by cholesterol are purified in the same patterns by DEAE-cellulose chromatography and gel filtration chromatography. As the results of gel filtration chromatographies, two active fractions are seperated high molecular weight fractions, Fl and low molecular weight fraction, F2. It is supposed that molecular weight of Δ^(1)-dehydrogenage in F1 is a 98,000 dalton and molecular weight of Δ^(1)-dehydrogenage in F2 is a 28,000 dalton by the oxido-reductase staining. F1 and F2 are characterized by substrate specificities relatively; F1 have a substrate specificity for cholestenone and F2 have a substrate specificity for hydrocortisone. In addition, the study for localization of the Δ^(1)-dehydrogenase is carried out by ultracentrifugation; the membrane fraction has a substrate specificity for cholestenone and the cytosol fraction has a substrate specificity for hydrocortisone. As the results of that, it is suggested that Δ^(1)-dehydmgenase(M.W.98,000) is seemed to be in the membrane fraction and Δ^(1)-dehydmgenase(M.W.28,000) is seemed to be in the cytosol fraction. It was observed that the optimum pH of Δ^(1)-dehydrogenase(M.W.98,000) is pH 8 and the optimum pH of Δ^(1)-dehydrogenase(M.W.28.000) is pH 9.