Cytochrome P450 유전자 발현과 그 cDNA cloning

Abstract

1. CYTOCHROME P450 I GENE FAMILY (ARYLHYDROGARBON HYDROXYLASE) Study has been carried out to examine the effect of benzo(a) pyrene, which is polycyclic aromatic hydrocarbon known as a environmental pollutant, on the gene expression of cytochrome P450 I in the rat liver. The different dose of benzo(a)pyrene was perfused to the isolated Sprague Dawley rat liver for various periods of time. Cytochrome P450 I mRNA was identified via dot blot hybridization using 3'specific portion of cytochrome P450 I cDNA.No change of cytochrome P450 I mRNA in Sprague Dawley female rat by benzo(a)pyrene treatment was observed. And the dose dependent increase of cytochrome P450 I mRNA with lower than 10^(-9)M of benzo(a)pyrene and decrease of cytochrome P450 I mRNA with higher than 10^(-9)M of benzo(a)pyrene were observed. These finding suggest that the possible autoregulation and sex specific regulation of cytochrome P450 I gene expression by benzo(a) pyrene. 2. CYTOCHROME P450 XIX (AROMATASE) Aromatase which converts androgen to estrogen is essential for the maintenance of pregnancy and normal development of fetus. The cloning of cytochrome P450 aromatase cDNA is important to understand the mechanism of action of this enzyme. In this study, a lambda gt 11 human placenta cDNA library was screened with biotinylated deoxyoligonucleotide that was obtained from the most 5'region of DNA sequence of partially coding human aromatase protein.After the screening 10^(9) plaques,12 positive clones were identified. Using these positive clones, secondary and tertiary screening were conducted.From the positive clone of tertiary screening, lambda DNA is isolated. The lambda DNA was digested with EcoRI and 2-3Kb EcoRI fragment out of lambda DNA were observed on 1% agarose gel electrophoresis. In order to confirm these EcoRI fragment being a cytochrome P450 aromatase cDNA, DNA sequencing of EcoRI fragment and cDNA expression should be carried out in future.;1. CYTOCHROME P450 Ⅰ 유전자군 (ARYLHYDROCARBON HYDROXYLASE) 본 실험에서는 담배, 자동차 배기 가스를 통해 환경 중에 널리 퍼져 있으며 폐암 유발원으로 알려진 다환상 방향족 탄화 수소 화합물 중 benzo(a)pyrene의 cytochrome P450 Ⅰ 유전자 발현에 대한 영향을 조사하였다. 백서 간에 benzo(a)pyrene 을 순환 관류하여 benzo(a)pyrene에 의한 cytochrome P450 Ⅰ mRNA양의 변화를 cDNA를 probe로 사용하여 관찰한 결과는 다음과 같다. (1) Sprague Dawley 자성 백서에서 cytochrome P450 Ⅰ 유전자 발현은 benzo(a)pyrene의 처치 농도와 시간에 무관하였다. (2) Sprague Dawley 웅성 백서에 benzo(a)pyrene 을 처치하였을 때, cytochrome P450 mRNA의 양이 처치 농도에 비례하여 증가하다가 다시 감소하였다. 또한 처치 6시간까지 시간에 비례하여 증가하였다. 이 결과는 Sprague Dawley종 백서에서 cytochrome P450 Ⅰ 유전자 발현에 성별 특이성이 있음을 암시하며, Sprague Dawley 웅성 백서에서의 처치된 benzo(a)pyrene의 농도에 따른 cytochrome P450 Ⅰ mRNA양의 증·감은 cytochrome P450 유전자 발현에 자가 조절 기전이 있음을 시사한다. 2. CYTOCHROME P450 XIX (AROMATATASE) Estrogen 생합성의 rate limiting 단계에 작용하여 steroid 모핵의 A환을 방향족화시키는 cytochrome P450 aromatase는 임신 유지 및 태아 발달에 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서 cytochrome P450 aromatase 의 cDNA cloning 이 그 작용 기전을 분자 생물학적으로 이해하는 데 도움이 될 것으로 여겨지는 바, 본 실험에서는 사람 태반으로부터의 cDNA library를 oligonucleotide를 Probe로 사용하여 screening하였으며 그 결과 10^(9)개의 lambda gt 11 clone 중 12 개의 양성 clone을 얻었고, 2차, 3차 screening을 통하여 얻은 양성 clone으로부터 lambda DNA를 분리하여 EcoRI 제한 효소 처리한 후 1% agarose gel electrophoresis하였을 때 2-3Kb의 DNA조각이 확인되었다. 이렇게 lambda gt 11으로부터 분리된 DNA가 cytochrome P450 aromatase cDNA 임은 헥산 서열 결정 및 cDNA 발현을 통하여 확인되어야 할 것이다.