The study of sonic hedgehog signaling in the generation of CD8+ memory T cells

Abstract

PART I CD8+ memory T cells offer enhanced host protection against re-infection and are known to be long-lived and self-renewing. Understanding the mechanisms behind the differentiation to CD8+ memory T cell is of increasing importance to develop vaccination strategies against a variety of established and emerging infectious diseases. However, it is not known how an antigen-specific population of memory T cells is generated and maintained throughout a life time. Recent studies have reported that self-renewing cell populations such as hematopoietic stem cells and memory T and B lymphocytes probably share common signaling pathways, because they maintain long lifespan and consistent population. Wnt, notch and hedgehog signalings were shown to be important in balancing between stem cell homeostasis and differentiation by self-renewing and proliferation. Based on these information, I tested whether sonic hedgehog (Shh), one of the most essential proteins that confer self-renewal property to stem cells, is actually involved in CD8+ memory T cell self-renewal. To test whether Shh signaling pathway is involved in generation and/or maintenance of CD8+ memory T cells, I used P14 transgenic mice expressing transgenic TCR specific to peptide gp33-41 of LCMV and restricted to H-2Db MHC. P14 splenocytes were adoptively transferred into recipient wild type mice and one day later, recipients were infected with LCMV intraperitoneally. Mice were sacrificed to acquire effector T cells at day 8 post infection (p.i.) and memory T cells at day 45 p.i.. Using this animal model, I investigated whether Shh is involved in CD8+ T cell memory generation and maintenance. As the first step, I checked the level of smoothened (Smo) expression on the surface of CD8+ memory T cells. Previously, the expression of smoothened itself was shown to be up-regulated upon activation of Shh-mediated signal. Although Smo expression was definitely higher in effector CD8+ T cells than in naïve and memory T cells, I observed slightly higher expression in memory T cells than in naive T cells. This increased expression implied that Shh signaling pathway may have functions on memory T cells. Therefore, I checked mRNA level of various components in Shh signaling pathway using real-time PCR. In memory cells, the mRNA levels of patched1 (Ptch1), Smo, Gli1, 2 and Shh itself increased compared to naïve T cells. The observed increase in the levels of Shh signaling components suggest a possibility of Shh involvement in CD8+ memory T cell generation. Next, to assess directly whether Shh signaling functions in the generation or maintenance of CD8+ memory T cells in vivo, the effect of blocking Shh signal was analyzed at animal level. Splenocytes from P14 transgenic mice were adoptively transferred into the wild type mice and intraperitoneally infected with LCMV. From the day 8 p.i., Shh signaling was blocked by injecting neutralizing antibody 5E1 and the frequency of CD8+H-2Db+cells were monitored by FACS analysis. Unlike our expectation, after 45 days, considered as a memory stage, the frequency of CD8α+ H-2Db+ T cells of 5E1 treated mice was comparable to those of control mice. These results suggest that Shh signaling has no significant effect on the generation of transition to CD8+ memory T cells.

PART II Sumo (small ubiquitin-like molecule) covalently conjugates to cellular target proteins and SUMO conjugation is involved in the regulation of various cellular processes, such as transcriptional regulation, apoptosis, protein stability, transportation between nucleus and cytoplasm, and cell cycle regulation. In contrast to ubiquitination which targets proteins for proteolysis by proteosomal degradation, sumoylation primarily regulates the function of substrate proteins by altering the protein interactions, intracellular localization or other kinds of post-translational modifications. Sumoylation is reversed by desumoylase. So far, the only identified desumoylation enzyme is SENP family (SUMO/sentrin-specific proteases) in mammals or Ulp(Ubiquitin-like protease specific protease) in yeast. The SENP family includes at least six family members encoded by six genes in mammalian cells. The members of SENP family share a conserved H, D, Q and C at C-terminus, participating in the catalytic activity which degrades peptide bonds. We have recently identified DeSI1, DeSumoylating Isopeptidase 1 (also called PPPDE peptidase domain containing 2) as the second class of desumoylase. DeSI1 was originally identified as a binding partner of a transcription factor BZEL, the function of which is still unknown. In a yeast two hybrid screening to identify the binding partners of BZEL, we found DeSI1 as a partner of BZEL. As DeSI1 belongs to a PPPDE superfamily (Permutated Papain fold Petidases of dsRNA viruses and Eukaryotes) of proteins that share similar secondary structural bases with cystein peptidase [33], we tested whether DeSI1 acts as a desumoylase and found that DeSI1 has a desumoylase activity against BZEL. Here, to find additional substrates that could be desumoylated by DeSI1, I performed yeast two hybrid screening of a mouse T cell lymphoma cDNA library using DeSI1 as a bait. After screening of a 3.2 X 107 clones, a total of 95 positives were obtained and 69 of them were rescued and sequenced. PCNA, RNA binding motif protein 3 and guanine nucleotide binding protein (G protein) beta polypeptide 2 like 1 (Gnb2l1) were presented 3 times. Beta-2 microglobulin (B2m), basigin transcript variant 1 (Bsg), ubiquitin, H3 histone family 3B and stem-loop binding protein (Slbp) were represented twice. Other positive candidates were all presented once. Further studies are required to verify whether DeSI1 has desumolyase activity to other potential binding partners.;PART I CD8+ 기억 T 세포는 재감염시에 숙주를 보호하는 능력을 강화시키고 긴 수명과 자가재생성(self-renewal)을 하는 것으로 알려져 있다. CD8+ 기억 T 세포가 분화하는 과정에 대한 이해는 다양한 감염성 질병을 치료하는 백신 개발 전략에 중요하게 여겨지고 있다. 그러나 어떻게 항원 특이적인 기억 T 세포군이 생성되고 유지되는지는 잘 알려져 있지 않다. 최근 연구에 의하면, 긴 수명과 일정한 개체군 유지의 특성을 통해 조혈모세포와 같이 자가재생성 (self-renewal) 하는 세포의 개체군와 기억 T, B 세포는 공통적인 신호전달 과정을 공유할 것으로 생각되고 있다. Wnt, notch 그리고 Sonic hedgehog (Shh) 신호전달과정은 자가재생성 능력과 분열능력을 통해 줄기세포 항상성과 분화의 균형을 유지하는데 중요한 것으로 알려져 있다. 이러한 정보들을 토대로, 여기서는 줄기세포의 자가재생성능력에 필요한 물질 중 하나인 Shh이 CD8+ 기억 T 세포에도 작용하는지 알아보고자 하였다. Shh 신호전달과정이 CD8+ 기억 T 세포의 생성과 유지에 참여하는지 알아보기 위해, LCMV의 gp33-41 peptide에 특이적이고 H-2Db MHC에 제한적인 형질전환 TCR을 발현하는 P14 형질전환마우스를 사용하였다. 감염된 쥐들을 희생시켜 감염후 8일 째에 effector T 세포와 45일 째에 기억 T 세포를 분리하였다. 실험의 첫 번째 단계로, CD8+ 기억 T 세포 표면에서 smoothened (Smo)의 발현을 조사하였다. 앞선 연구들에 의하면 Smo는 Shh 신호전달과정의 활성에 의해 발현이 촉진되는 것으로 알려져 있다. 비록 Smo의 발현이 CD8+ 기억 T 세포나 naïve T 세포보다 CD8+ effector T 세포에서 확연히 높은 결과를 얻었지만, CD8+ 기억 T 세포에서의 발현 또한 naïve T 세포에서보다는 높은 것을 알 수 있었다. 증가한 발현량을 통해 Shh 신호전달과정이 기억 T 세포에서 기능을 할 수 있음을 시사해 주고 있다. 그러므로, 여기에서는 여러가지 Smo 신호전달구성물질의 mRNA 발현량을 real-time PCR로 측정해보았다. 기억세포에서, patched1, smoothened, Gl1,2 그리고 Shh 의 mRNA 발현량이 naïve 세포에 비해서 증가 한 것을 확인하였다. 구성물질들의 증가는 Shh 신호전달과정의 기억세포 형성과정에서의 참여 가능성을 제시한다. Shh 신호과정의 직접적인 참여를 확인하기 위하여 Shh 신호전달과정의 차단을 동물수준에서 분석하였다. 쥐의 LCMV 감염을 통해 effector와 기억 T 세포를 만들도록 하였다. P14 형질전환 쥐로부터 얻은 비장세포를 wild 쥐에 adoptively transfer 한 뒤 LCMV 로 복강 내 감염시켰다. 감염 후 8일째부터 Shh 차단 항체를 복강 내 투여해 CD8+H-2Db+ T 세포의 생성 빈도를 FACS로 분석하였다. 예상과는 달리, 기억 세포 단계로 여겨지는 45일 후 Hedgehog (Hh) 단일클론항체 5E1을 처리했을 때 CD8+H-2Db+ T 세포의 빈도수는 대조군과 차이를 보이지 않았다. 이 결과들을 통해 Shh 신호전달과정은 CD8+ T 세포의 기억 세포로의 전이에 필수적인 요소로 여겨지지 않음을 확인할 수 있다.  

PART II SUMO (Small ubiquitin-like molecule)는 표적이 되는 단백질에 공유적으로 결합하고, 이러한 SUMO modification은 전사조절, 세포사멸, 단백질 안정성, 핵과 세포질 내의 물질 이동, 혹은 세포 주기 조절 같은 다양한 세포 활동 과정을 조절하게 된다. Proteosomal 분해로 대상 단백질을 가수분해 시키는 ubiquitination과 달리, sumoylation은 단백질 간의 상호작용이나, 세포 내부의 위치 혹은 다른 번역 후기 modification을 변화시킴으로서 기질 단백질을 일차적으로 조절한다. Sumoylation 은 desumoylase에 의하여 상태가 역전된다. 지금까지 유일하게 밝혀진 desumoylase는 포유류에서 SENP family (SUMO/sentrin-specific protease) 이고 효모에서는 Ulp(Ubiquitin-like specific protease) 이다. SENP family는 적어도 6개의 family member들을 포함하고 포유류 세포에서 6개의 유전자에 의해 encoding 된다. SENP family member들은 C-말단 부분에 conserve된 H, D, Q 그리고 C기를 가지고 있어서 peptide 결합을 분해하는 촉매 활동에 참여한다. 우리는 최근 연구에서 DeSI1, DeSumoylation Isopeptidase 1 (also called PPPDE peptidase domain containing 2) 를 desumoylase의 두번째 그룹으로 발견하였다. DeSI1은 원래 Yeast two hybrid screening을 통하여 기능이 아직 잘 알려지지 않은 전사인자 BZEL의 결합 파트너로 발견되었다. DeSI1은 PPPDE superfamily (Permutated Papain fold Petidases of dsRNA viruses and Eukaryotes) 단백질군에 속해서 cystein peptidase와 유사한 이차구조를 가지고 있기 때문에, 우리는 DeSI1이 deubiquitinase 혹은 desumoylase로 작용하는지 알아보고자 하였고, DeSI1은 desumoylase activity를 가지고 있는 것을 발견하였다. 게다가, sumoylated PCNA와 BZEL이 DeSI1에 의해 desumoylation 된다는 것도 확인하였다. 여기서는, DeSI1에 의해 desumoylation 되는 또 다른 기질단백질을 찾기 위해, DeSI1을 bait로 사용해 mouse T 세포 림포마 library의 yeast two hybrid screening을 시행하였다. 1.06 X 106 개의 클론들을 screening한 결과, 전체 95개의 positive을 얻었고 그 중 69개의 클론들을 rescue 한 후 sequencing 하였다. Proliferating cell nuclear antigen(PCNA), RNA binding motif protein 3 그리고 guanine nucleotide binding protein(G protein) beta polypeptide 2 like 1(Gnb2l1) 는 각각 세 번씩 결과를 얻었다. Beta-2 microglobulin(B2m), basigin transcript variant 1(Bsg), ubiquitin, H3 histone family 3B 와 stem-loop binding protein(Slbp)은 두 번씩의 결과를 얻었다. 나머지 가능한 후보 파트너들은 각각 한 번씩 나타났다. 앞으로의 연구에서는 DeSI1이 desumoylase로서의 기능을 가지는 다른 잠재적인 결합 파트너의 발견이 필요할 것이다.