Identification and Characterization of Antibodies Specific for EGFR By Phage display

Abstract

Phage display 는 높은 친화성과 표적특이성을 가지고 있어 항체단편을 빠르게 선별하기 위한 가장 강력한 방법이다. 이런Phage display방법이 다른 항체제조방법과 비교했을 때 가장 큰 장점은hybridoma 기술과 달리in vitro 에서 항체를 선별하는 과정이 실행된다는 것이다. 이런 Phage 발현 기술을 이용해 무작위적으로 다양성을 지닌 항체 유전자를 인위적으로 제작하고 이를 박테리오파지의 표면에 발현하는 기술로 다양한 항체를 제작할 수 있다. 상피세포성장인자수용체(EGFR, HER1 and ErB1)는 타이로신 카이네이즈 수용체 에 속하는 막단백질이다. EGFR 은 여러 신호전달기작역할을 하는 타이로신 카이네이즈 (TK)를 가지고 있고 이는 외부의 신호를 받으면 세포의 분화를 촉진하는 특이적 세포 내 신호전달 경로를 통해 핵 안으로까지 신호를 전달해 수많은 돌연변이들이 발생되어 암세포의 분화, 성장, 사멸, 세포이동 등에 관여 한다. 따라서, EGFR 저해제는 생리학적과 병리학적인 치료의 과정에 중요한 역할을 하고 있다. 우리는 여기서 인산화된EGFR-Y1173과 cetuximab-captured EGFR 항원을 human synthetic library 와 pooled rabbit immune library와 함께 이용하여 phage display 방법으로 특정한 결합클론을 찾는 실험을 진행하였다. 여기서 찾은 클론들은 ELISA로 인산화된EGFR대한 친화성을 확인하고 immunoblot, dot blot, sandwich ELISA 그리고 면역침강법으로 더욱더 확실하게 EGFR과 인산화된EGFR에 결합하는지 보였다. 이렇게 phage display로 규명된 항체들은 생물학 연구 및 임상 연구에 있어서도 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.;Antibody phage display is a powerful method of rapidly isolating high affinity and target specific antibody fragments. One of the key advantages of antibody phage display compared with other antibody-producing methods such as hybridoma technique is that the antibody selection process is performed in vitro. The epidermal growth factor receptor (EGFR, HER1, ErB1) is a transmembrane protein of the tyrosine kinase receptor family. EGFR plays an important role in physiological and pathological processes such as cell cycle progression, differentiation, apoptosis, migration, and invasion. EGFR phosphorylation is of particular importance among the post-translational modifications of the protein, because this reversible modification plays a central role in the regulation of cellular signaling and metabolic pathways by altering the activity of EGFR. Here we report the isolation of antibodies specific for the nondenatured form of EGFR and also for EGFR phosphorylated at Tyr1173 residue (EGFR-pY1173) from a large human synthetic library and a pooled rabbit library. These clones were tested for their ability to recognize the target in ELISA, immunoblot assay, dot blot, sandwich ELISA and immunoprecipitation experiments. We could conclude from this study that screening and identifying antibodies from the phage-displayed antibody libraries will provide broad applications in biological and clinical research.