A Simple HPLC Method for Quantification of NOX Inhibitor in Rat Plasma and Its Application to Pharmacokinetic Study

Abstract

NADPH oxidase (NOX) proteins are membrane-associated, multiunit enzymes that catalyze the reduction of oxygen using NADPH as an electron donor. It has been reported that NOX enzymes are function to generate reactive oxygen species (ROS) which participate in many signaling pathway. NOX proteins are also known as a regulator of various fundamental physiological processes including cell growth, differentiation, apoptosis, host defense and cytoskeletal remodeling. The mis-regulation of the expression and activation of NOX enzymes often results in the development of various diseases including atherosclerosis, hypertension, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis and diabetes. Therefore, it is necessary to develop selective inhibitors of these enzymes. The lead compound of NOX inhibitors studied previously, E89403, was unstable in rat plasma with very low oral bioavailability. The objectives of the present study were to develop and validate a specific HPLC method for the determination of NOX inhibitor candidate compounds which possess modified functional groups on core structure of E89403 in rat plasma and to evaluate its pharmacokinetics in rats after IV and oral administrations. The HPLC method developed in this study was successfully validated with specificity, linearity, precision, and accuracy for the analysis of NOX inhibitors in rat plasma. The effects of slight modification of chemical structures on the pharmacokinetics of NOX inhibitors were investigated following IV injection and oral administration at doses of 2 mg/kg and 20 mg/kg, respectively, to rats. NOX inhibitors, # 18-066 and # 18-079 which had slight modification on the upper left side of E89403 were little more stable in rat plasma as compared with the lead compound, E89403 but still rapidly eliminated with poor absolute bioavailability (4.3 and 5.5 %, respectively). However, an attachment of a propyl group on the upper right side of E89403 (#18-211) resulted in remarkable improvements in stability and absolute bioavailability. The stability results of #18-211 conform to the accepted limits. Initial and maximum concentrations of #18-211 were dramatically increased with significant decrease in total clearance as compared with the other two NOX inhibitors, #18-066 and #18-079. Its absolute bioavailability was 54.6%, which was approximately 10-fold greater than those of #18-066 and #18-079. These results suggest that chemical structure may be one of very important factors to determine in vivo stability and pharmacokinetic profiles of drug candidates.;NADPH oxidase (NOX) 단백질은 세포 막에 존재하며 여러 개의 소단위로 구성된 효소로서 NADPH를 1 전자 공여체로 이용하여 산소 분자의 환원 반응을 촉매한다. 이 NOX 효소는 많은 신호 전달 체계에 참여하는 활성 산소 종(ROS)의 생성에 관여한다고 알려져 있다. NOX 단백질은 또한 세포의 성장, 분화 및 사멸과 생체 내 면역반응, 그리고 골 재형성에 이르는 다양한 기초 생체 반응의 조절자로도 알려져 있다. NOX enzyme의 발현과 활성화가 잘 조절되지 않을 경우 동맥경화, 고혈압, 섬유화, 류마치스성 관절염, 당뇨 등 많은 질병의 원인이 될 수 있다. 따라서 이 효소의 특이적인 억제제 개발이 필요하다. 이전에 연구된 NOX inhibitor의 선도 물질인 E89403은 쥐 혈장에서 낮은 안정성을 보였으며 그것의 경구 생체 이용률 또한 매우 낮았다. 이번 연구는 선도 물질의 모핵 구조에 기능기를 추가하여 NOX inhibitor로 활용될 가능성이 있는 후보 물질의 HPLC 분석 방법을 개발하고 그것을 실험용 쥐에 정맥 혹은 경구 투여 한 후 Pharmacokinetic parameter를 도출하는 것을 목적으로 한다. 이번 연구에서 확립된 HPLC 분석 방법은 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성 측면에서 그 방법의 유효성이 성공적으로 입증되었다. 화학 구조의 변화가 NOX inhibitor의 약물 동태에 미치는 영향에 대해서는 실험용 쥐에 2 mg/kg, 20 mg/kg 용량으로 각각 대퇴부 정맥과 경구로 투여하여 실험하였다. 선도물질 E89403의 왼쪽 윗부분에 기능기를 삽입한 # 18-066 과 # 18-079 의 경우 혈장 중에서의 안정성이 약간 증가하기는 했지만 여전히 체내에서 빠르게 배출되어 낮은 절대 생체 이용률을 보였다. (각각 4.3 and 5.5 %). 그러나 E89403의 오른쪽 위에 propyl 기를 추가한 #18-211의 경우에는 혈장 중 안정성과 절대 생체 이용률 모두에서 확실히 개선된 결과를 보였다. 안정성 실험 결과는 허용 한도 안에 포함되었으며 #18-066 또는 #18-079와 비교했을 때 혈중 초기 농도와 최고 농도는 증가하고 총 clearance는 크게 감소하였다. #18-211의 절대 생체 이용률은 54.6%로써 이것은 #18-066 또는 #18-079보다 10배 가량 증가한 수치이다. 이상의 결과로부터 화학적 구조가 약물 후보 물질의 in vivo 상의 안정성과 약물 동태학적 윤곽을 결정하는 중요한 요인이 될 수 있다는 결론을 얻었다.