생장 온도별 Campylobacter jejuni ATCC 33560 세포내 단백질 발현 양상에 관한 연구

Abstract

Campylobacter spp. are motile, Gram-negative, microaerophilic and causative agent of human food-born gastroenteritis. Campylobacter jejuni grows best at the body temperature of a poultry, and seems to be well adapted to poultry. The main reservoir of C. jejuni is poultry, humans can become infected through consumption of undercooked chicken or cross-contamination of other foods that is contaminated with the bacterium. Despite the medical and economic importance of C. jejuni infection, colonization and pathogenicity of C. jejuni in the human gastrointestinal tract is not yet fully understood. therefore, we aimed to determine the intracellular protein expression profiles of C. jejuni cultured at 37℃ and 42℃ in vitro by 2-DE. Especially, secA gene translation of only observed cultured at 37℃ were analyzed in different growth condition using RT-PCR. The result of intracellular proteins spots on the 2-DE gels revealed that 39.5% were up-regulated and 46.9% were down-regulated at 37℃. In addition, 19 spots(7.9%) were uniquely present in C. jejuni cultured at 37℃. Results of MALDI-TOF/PMF of 19 spots revealed that 9 spots were identified 6 proteins including ABC transporter, a protein coded by CJE0475, RecA, LigA, AspS, MetE, SecA. To confirm of transcriptional level of secA that expected related with virulence factor implemented RT-PCR. Although SecA was not observed on 2-DE gel at 42℃ culture condition, RT-PCR data show that expression level of secA gene cultured at 37℃ condition is higher than cultured at 42℃ condition approximately 10 fold. C. jejuni cultured at chicken temperature(42℃) was transfer at human temperature(37℃) and measured expression level of secA gene using RT-PCR. Expression level was decreased until 10 minutes but reached 2 fold of basal expression level at 1hour. In conclusion, SecA is a highly conserved protein whose expression in C. jejuni is induced at human body temperature. Therefore SecA contribute to secrete virulence factors or indirectly effect factors related virulence. This study will provide a basis for further investigation of the pathogenesis mechanism in human.;Campylobacter spp.는 그람 음성 간균으로 운동성을 가지고 있으며 미호기적 조건에서 생장하며 인체에 감염하여 campylobacteriosis를 일으키는 식품매개성 병원균이다. 적정생장 온도가 42℃인 C. jejuni의 인체감염은 닭의 장 내부에서 피부 등으로 도계과정 중에 전파된 균이 완벽하지 않은 조리 혹은 다른 음식으로의 교차오염을 통해 섭취, 발생되어지며 campylobacteriosis는 주로 일반적인 장염의 증상으로 나타나 저절로 회복되는 경우가 많으나 소수의 경우 Guillain-Barre Syndrome(GBS), 관절증, 신경마비 등의 후유증을 가져오기도 한다. 발생빈도와 임상학적 중요성이 증가하고 있으나 발병기작이 완전히 밝혀지지 않고 있으며, 닭에서 사람에게로의 감염경로 역시 명백하게 밝혀지지 않았다. C. jejuni의 가금류와 사람에서의 각기 다른 colonization mechanism을 이해하고 체온에 따른 단백질의 발현을 알기 위하여 가금류(42℃)와 사람(37℃) 각각의 체온에서 배양한 C. jejuni ATCC 33560 intracellular protein의 profiling을 이용하여 단백질 발현을 분석하였고 사람의 설사 질환과 관계가 있을 것으로 생각되는 virulence factor 관련 단백질을 선정하여 전사수준에서 그 발현양을 확인하였다. 먼저, 닭의 체온(42℃)와 사람의 체온(37℃)에서 배양한 균주의 단백질 발현 양상을 2-DE를 통해 확인한 결과, 42℃에서 배양한 균주에 비하여 37℃에서 배양한 균주로부터 발현이 증가한 spots은 전체 spots의 39.5%에 해당하였고 발현량이 감소한 spots은 46.9%에 해당하였으며, 발현이 억제된 spots은 6.9%였고, 37℃에서 배양한 균에서만 발현한 spots은 19개로 전체의 7.9%였다. 37℃ 배양 조건에서만 발현된 19개의 spots을 대상으로 MALDI-TOF를 이용해 PMF 동정한 결과 총 9개 spots이 ABC transporter, CJE0475 coding protein, RecA, LigA, AspS, MetE, SecA로 확인되었다. 다음으로 virulence factor와 관련있다고 여겨지는 SecA를 이용하여 전사수준에서 그 발현양을 확인하였다. SecA는 cytoplasm에서 생성되는 preprotein의 receptor이자 ATP-dependent motor로 작용하는 sec pathway의 중심인자로써 2-DE 상에서는 37℃ 생장 조건에서만 발현하였지만, RT-PCR 결과 42℃에서도 SecA의 발현이 확인 되었다. 하지만 그 양이 37℃ 생장조건에서 배양한 균에 비해 1/10정도 수준에 해당하였다. 42℃에서 배양한 균을 37℃로 배양 온도를 바꾸어 시간에 따른 SecA의 발현량을 확인 한 결과 37℃로 배양 온도를 바꾼 뒤 10분후 까지는 SecA의 발현이 감소하였으나, 이후 배양 시간에 따라 점사 SecA의 발현양이 증가하였고 1시간에 이르러서는 초기 발현량의 약 2배 까지 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 사람의 체온인 37℃에서 SecA의 발현이 증가한 것으로 보아 사람과 닭에서의 다른 colonization 환경 요소 중에서 온도차에 따른 SecA의 발현의 차이가 Campylobacter jejuni의 virulence factor 분비에 영향을 미치거나 virulence factor와 관계된 요소에 간접적으로 작용할 수 있다고 여겨진다 따라서 본 논문은 닭과 사람에서의 다른 colonization 기작과 인체에 campylobacteriosis를 일으키는 pathogenic mechanism의 발견에 기초자료로써 기여할 수 있을 것으로 사료된다.