한국산 노랑초파리 a-Gpdh 인자의 DNA 다형현상에 관한 연구

Abstract

한국산 노랑 초파리(Drosovhila melanogaster)의 GPDH 효소 활성도, 체내의 GPDH 효소량, Gvdh인자의 duplication과 Gpdh를 포함한 18Kb 부위의 DNA상의 유전자 변이 양상을 알아보고 그들간의 연관관계를 규명하고자 천안 집단으로부터 12 계통, 부산 집단으로부터 15계통 등 모두 27계통을 대상으로 하여 흡광도 측정을 통한 효소 활성도 측정과 radial immunodiffusion을 통한 GPDH 효소량(CRM)을 측정하였다. 또한, Southern blotting analysis를 실시하여 restriction map을 작성하고 DNA 다형 현상 분석하였으며, Gpdh 인자의 duplication이 확인된 계통에 대해서는 PCR product의 제한효소 처리를 통해 duplication fragment에 대한 계통간의 유사성의 여부를 분석하였다. 1. 27계통을 대상으로한 표소 활성도 측정결과 최저 245.9, 최고 542.8unit/mg의 전체적으로 폭넓은 범위의 효소 활성도를 갖는 것으로 나타났고 천안 집단의 효소 활성도와 부산 집단의 표소 활성도는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한, GPDH^(SS)의 평균효소 활성도가 GPDH^(FF)의 평균 표소 활성도보다 1.2배정도 높은 것으로 나타났으며 이는 GPDH^(SS)가 GPDH^(FF)에 비해 duplication 빈도가 높게 나타났기 때문이라고 분석되었다. 2. Radial immunodiffusion을 통한 GPDH 표소량(CRM) 측정 결과 GPDH^(SS)의 평균 CRM이 GPDH^(FF)의 평균 CRM에 비해 높은 것으로 분석되었다. 또한, 27계통을 대상으로 한 GPDH CRM측정 결과 흡광도에 의한 효소 활성도와 유사한 양상을 나타내었다. 3. Southern blotting analysis를 실시한 결과 25개의 제한표소 좌위중 5개의 좌위: PsfI(-2.35)/ XbaI(-1.7), HindIII(0.0), HindIII(+0.25), PstI(+5.7)가 다형 현상 보이는 것으로 나타났으며(20%), 2종류의 삽입인 I(a)-140bp, I(b)-8000bp와 3종류의 결실인 D(a)-150bp, D(b)-400bp, D(c)-340bp가 관찰되었다. 또한, 이러한 삽입과 결실은 Gvdh 구조유전자의 upstream에 위치한 -7.0 site에서 -5.5 site와 intron 부위에 존재하는 것으로 분석되었다. 4. 27계통에 대한 전체적인 haplotype diversity, h,는 0.968이며 GPDH^(SS)의 haplotype diversity는 0.982, GPDH^(FF)의 haplotype diversity는 0.997로서 GPDH^(SS)에 비해 높은 것으로 나타났다. 5. 27계통을 대상으로 한 다형 현상간의 전체적인 linkage disequlibria를 분석한 결과 HindIII(+0.25)와 I(a)-140bp사이, 그리고 PstI(-2.35)와 D(a)-150bp사이에 강한 연관관계를 갖는 것으로 나타났다. 6. Southern blotting analysis를 실시한 결과 27계통중 10개의 계통(37%)에서 Gpdh 좌위가 duplication이 된 것으로 관찰되었으며 PCR을 실행한 결과 역시 동일한 계통에서만 739bp의 PCR product가 형성되었다. 또한, 739bp의 PCR products를 4가지의 제한효소로 처리한 결과 동일한 길이의 절편들이 형성되었다. 즉, Gpdh좌위가 duplication이 된 10개의계통에 대해서는 모두 동일한 형태의 duplication 구조를 갖는다고 할 수 있다. 7. 27계통 중 Gpdh 좌위가 duplication이 된 계통은 duplication이 되지 않은 계통에 비해 GPDH 표소 활성도와 CRM이 높게 나타났으며, 또한 GPDH 효소 활성도와 CRM 사이에 강한 상관 관계를 갖는 것으로 분석되었다(r=0.82).;Restriction site variation in 18-kb region including the Gpdh (sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase) locus has been assessed in 27 isofemale lines, 12 lines from the Choˇunan population and 15 lines from the Pusan population in Korea. Of the 25 restriction sites that were scored, 5 sites were polymorphic(20.0%): PstI(-2.35), XbaI(-1.7), HindIII(0.0), HindIII(+0.25) and PstI(+5.7). Two kinds of insertions(I), three kinds of deletions(D) and five kinds of restriction site variations were detected. All restriction site and length polymorphisms were located in introns and outside region of the Gpdh structure gene: the area from -7.0 site to -5.5 site. The proportion of polymorphic nucleotides, p, for all 27 lines was 0.019 and the estimated heterozygosity per nudeotide pair, θ, was 0.013. Sixteen kinds of restriction map haplotypes of all lines analyzed were detected. Few lines were identical at the restriction map level. Most haplotypes were observed only once. The estimated haplotype diversity, h, was 0.968. The haplotype diversity(0.997) for Gpdh^(FF) bearing chromosomes was slightly higher than those(0.982) for Gpdh^(SS) chromosomes. Analysis for linkage disequilibria between the polymorphisms also showed that HindIII(+0.25) vs. I(a) and PstI(-2.35) vs. D(a) have relatively high level of the linkage disequlibria in these populations. There were no significant associations between restriction site polymorphism and GPDH activity in 27 second-chromosome lines. However, the effect of length variation on GPDH activity is different. The activity of lines with deletion was lower than without, while there was no the effect of activity on insertion. The Gpdh locus was duplicated in about one-third of the 27 isofemale lines. The duplicated lines in both population had higher levels of GPDH activity and GPDH CRM than those of nonduplication lines. In a further investigation of the duplication structure, genomic DNA from 27 isofemale lines was amplified in the PCR with the primers DG1 and DG2. 739 base fragment was observed in all ten duplicated lines, while no amplified fragment was observed in the nonduplicated lines. Restriction digests of the amplified products showed that all lines with duplication produced the same sizes of fragment. The duplication is shown to have a similar structure in each population investigated and is also present in population from China, Africa and Australia.