Characterization of Secreted Vesicles from Insulinoma cells

Abstract

Insulinoma NIT-1, an insulin-secreting mouse cell line, secretes vesicles in response to glucose or calcium. These vesicles, like exosomes, are relatively homogeneous (30−100 nm). I analyzed their protein profiles employing one-dimensional SDS gel electrophoresis combined with nanoLC-ESI-q-TOF tandem mass spectrometry, and searched for post-translational modifications (PTMs) using MODi algorithm. I identified 270 proteins which matched at least two peptides reproducibly in duplicate runs. These proteins included metabolic proteins, endocytosis/exocytosis related proteins, chaperones, cytoskeletal proteins, membrane transporters/ion channels, signaling molecules, and nucleic acid binding proteins. Over 200 of these are newly identified proteins for the first time in secreted vesicles, and included RNA- and translation-related proteins, ubiquitin- and protein-degradation related proteins and post-translationally modified proteins. The rest of the proteins identified in this study were similar to those reported by others to be present in exosomes of various origins. The present study demonstrates that vesicles secreted from insulinoma NIT-1 cells have some properties, common to exosomes from lymphocytes and cancer cells, and some differing from those of other types of exosomes. I believe that the modified and newly identified proteins I identified in secreted vesicles from insulinoma NIT-1 cells have the potential to provide insights into mechanisms of biogenesis and function of secreted vesicles and may help explain the impairment of insulin secretion in islets from type 2 diabetes. Secretagogin (SCGN) is a novel hexa-EF-hand calcium binding protein, highly expressed in pancreatic β-cell and neuroendocrine cells, especially in insulinoma cells. I detected SCGN in secreted vesicles under calcium treatment as well as normal condition. Although the biological function of SCGN is suggested to be involved in insulin secretion, the molecular mechanism of this functional role in vivo is not well understood. In this study, the structural studies as a calcium binding protein and functional studies relating to secretion were carried out. First, structural studies of SCGN were conducted by nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS. It is known that three dimensional structures of calcium binding proteins are changed depending on calcium concentrations and regulated the protein-protein interactions and cellular functions. Secondly, cellular localization of SCGN in pancreatic β-cells and insulinoma NIT-1 cells were performed. The localization of protein gives the information on the clue of the function. Thirdly, the amount of secreted vesicles was measured in time dependent manner in HeLa cells and dose dependent manner in NIT-1 cells overexpressing SCGN. Also, Glucose uptake analysis was performed employing fluorescence. The results will give us the clues on understanding the secretary mechanism of SCGN as a calcium binding protein;인슐린을 분비하는 mouse 세포주인 NIT-1은 glucose 또는 칼슘에 반응하여, vesicle을 분비하는 세포이다. 분비된 vesicle들은 exsosome과 같이 상대적으로 homogeneous하다 (30-100 nm). Vesicle에 존재하는 단백질들의 profile은 1D SDS gel electrophoresis를 통해 NanoLC-ESL-q-TOF tandem mass spectrometry로 분석하였고, MODi algorithm을 이용하여 단백질의 post-translational modification을 찾았다. 반복 실험을 통해 최소 두 개의 peptide가 일치한 270 가지의 단백질이 규명되었다. 이러한 단백질은 metabolic proteins, endocytosis/exocytosis related proteins, chaperones, cytoskeletal proteins, membrane transporters/ion channels, signaling molecules 그리고 nucleic acid binding proteins을 포함하고 있다. 규명된 270 가지의 단백질 중, 200 여가지 이상이 분비된 vesicle에서 새로이 규명된 단백질이다. 여기에는 RNA- and translation-related proteins, ubiquitin- and protein-degradation related proteins 그리고 post-translationally modified proteins이 포함된다. 이 외의 단백질은 다양한 origin의 exosome에 존재한다고 알려져 있는 것과 유사한 단백질이다. 이번 연구에서 인슐린 종 NIT-1 세포에서 분비되는 vesicle 은 lymphocytes와 cancer cells의 exosome과는 공통점을 가지고, 다른 유형의 exosome과는 약간의 차이점이 있다는 특성을 보여준다. 변형되어있고 새로이 규명된 인슐린 종 NIT-1 세포로부터 분비되는 vesicle내의 단백질들은 biogenesis의 기작과 분비된 vesicle의 기능에 관한 정보를 제공하고, type 2 당뇨에서 손상된 인슐린 분비에 관한 설명을 도와줄 수 있다. Secretagogin (SCGN)은 새로운 6개의 EF-hand를 가진 calcium 결합 단백질로서, 췌장의 베타 세포와 신경 내분비 세포에 많이 발현되어있고 특히 인슐린 종 세포에 많이 발현되어있다. 정상상태뿐 아니라, calcium 처리시에 분비된 vesicle 내에서 SCGN을 발견했다. 비록 SCGN 의 생물학적 기능이 인슐린 분비와 연관이 있을 것이라고 생각되지만 분자적인 기작은 잘 알려져 있지 않다. 이 연구에서는 칼슘 결합 단백질로서 구조적인 연구와 분비와 관련한 기능적인 연구를 했다. 첫째, SCGN의 구조적인 연구는 nanoLC-ESI-q-TOF tandem MS를 이용했다. 칼슘 결합 단백질의 3차 구조는 칼슘의 농도 변화에 따라서 변화하며, 이는 단백질간의 상호작용과 세포 내 기능을 조절한다고 알려져 있다. 둘째, 췌장의 베타 세포와 인슐린 종 NIT-1 세포에서의 SCGN 의 localization을 연구했다. 단백질의 localization은 기능에 대한 정보를 제공한다. 셋째, 분비된 vesicle의 양은 SCGN이 과 발현 된 HeLa 세포에서 시간의존적으로, NIT-1 세포에는 SCGN의 발현 양에 의존적으로 측정되었다. 또한, glucose uptake 분석은 fluorescence을 이용했다. 이러한 결과들은 칼슘 결합 단백질로서 SCGN 의 분비 기작을 이해하는데 중요한 단서를 줄 것이다.