SH3 domain containing, Ysc84-like 1 (SH3YL1) acts as dominant negative molecule for Noxa1

Abstract

Although reactive oxygen species (ROS) are classically described as harmful byproducts in aerobic metabolism. Many reports have demonstrated that ROS play crucial roles in a variety of biological processes, such as host defense, signal transduction, and hormone synthesis. It has been well established that NADPH oxidase 1 (Nox1) requires two cytosolic proteins, Nox organizer 1 (Noxo1) and Nox activator 1 (Noxa1) and GTP-binding protein Rac1. Noxa1 can interact with Noxo1 via COOH-terminal SH3 domain and contains a Rac-binding TPR domain in the NH2-terminal region. In this report, we show that a novel protein, SH3YL1 (Src homology 3 domain containing, Ysc84-like 1) can interact and regulate NADPH oxidase 1 complex. Yeast two hybrid, GST pull down and co-immunoprecipitation experiments indicate that SH3YL1 interacts with Noxo1 and COOH-terminal region of Nox1. Binding and membrane translocation of SH3YL1 with Noxo1-GFP was increased in response to EGF stimulation. We analyzed the function of SH3YL1 in NADPH oxidase 1 activity. Expression of SH3YL1 into HEK293T cells expressing Nox1/Noxo1/Noxa1 resulted in significantly reduction of ROS generation in response to EGF. Moreover, interaction and membrane translocation of Noxo1 with Noxa1 was disrupted the ectopic expression of SH3YL1. Activation of Rac was decreased in HEK293T cells expressiong SH3YL1. Taken together these results suggest that SH3YL1 acts as dominant negative molecule in Noxa1 and regulate Nox1 activity.;활성산조종(Reactive oxygen species)은 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되거나 펩티드 성장인자, cytokine들 및 다양한 작용의 자극에 의해 발생된다. 이 활성산소종은 free radical을 가져 안정하지 못한 상태를 말하며, 그로 인해 강한 활성을 나타낸다. 활성산소종은 생산이 과잉되면 생체에 대한 독성 즉 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여, 유해산소라고 명명되기도 하는데, 세포내의 단백질, 지질과 같은 거대한 분자를 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고, 세포를 사멸시키는 등 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발하며, 암, 근이형증, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 허혈성질환, 동맥경화증과 같은 다양한 퇴행성 질병의 원인과 일반적 노화와 관계가 있다. 하지만 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어서는 세포내 신호전달 과정에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger)임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응들을 유도하는 기능을 가진다는 것이 밝혀짐으로써 세포 사멸을 유도하는 인자로 인식되어 왔던 활성산소가 근래에 와서는 그 반대로 세포 사멸을 억제할 수 있음이 확인되고 있다. 암세포에 있어서도 마찬가지로 그 정상생리를 교란시켜 apoptosis를 유발 할 수도 있고 cell cycle arrest 효과를 나타내어 암세포수의 증식을 억제할 수 도 있음에 따라 활성 산소는 발암과 항암의 병리 과정에 공통으로 관여하는 양면성을 지니고 있음이 밝혀지고 있다. NAD(P)H oxidase는 이러한 활성산소종의 중요한 생성원으로 알려져 있으며 그 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2(Nox2, gp91phox)의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어져 있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도하여 그 결과 효소적 활성을 가지는 NAD(P)H oxidase complex가 형성되고, 이를 통해 전자의 이동이 일어나 활성산소종이 생성된다. 이렇게 생성된 활성산소종은 포식세포의 면역과정에서 침입한 병원균을 포식세포 내로 함몰하여 죽이는 과정에서 중요한 역할을 한다. 최근 포식세포뿐만 아니라 비포식세포를 포함한 다양한 세포에서 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 발견되었으며 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. 그 중 처음으로 발견된 Nox1은 Nox2와 56%의 유사한 아미노산 구조를 보이며 활성산소를 생성하는데 있어서 중요한 보조인자인 p47phox, p67phox가 동일하게 작용한다는 것과 그 외에도 보조인자의 유사체인 Noxo1(p51phox), Noxa1(p41phox)이 존재하여 그 단백질들에 의해서도 Nox1의 효소활성이 조절된다고 보고되었다. 또한 Noxa1은 p40phox와의 결합을 보이지 않지만 Rac과의 결합 또한 형성함으로 인해 Nox1을 활성화 시킨다는 것이 보고되었다. Nox1 생화학적 기능을 더 깊이 이해하고 조절기전을 밝히기 위해 우리는 먼저 Yeast two hybrid system을 이용하여 Noxo1과 결합하는 여러 가지 단백질들을 찾아내었고 그 중에 하나가 바로 SH3YL1 이라는 단백질이다. 이 단백질은 쥐에서 먼저 연구가 되었는데 모발이 자라는 시기에 많이 발현된다고 보고 되었으며 사람의 단백질과는 97%의 유사성을 보인다. 사람의 단백질인 SH3YL1은 그 기능에 대해 밝혀진 것이 없는 새로운 단백질이며 이것이 Noxo1과 강한 결합을 보이는 것을 확인함으로 Nox1의 효소 활성에 미치는 영향이나 그 조절 기작을 알아 보고자 연구를 진행하였다. 이러한 SH3YL1 단백질과 Noxo1이 결합한다는 사실을 관찰한 후 SH3YL1이 나머지 Noxo1이외에 Nox1과 그 보조인자 들과 결합하는지 알아보고자 in vitro GST pull-down assay를 수행하였는데 흥미롭게도 SH3YL1은 Noxo1 뿐만 아니라 그것의 유사체인 p47phox 그리고 Nox1과도 결합한다는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 in vivo co-immunoprecipitation(Co-IP)을 통해 재차 확인할 수 있었으며, 이 결합이 활성산소종의 생성을 유도하는 것으로 알려진 성자인자 중 하나인 EGF 자극에 의해 더 강해지는 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 SH3YL1와 NADPH oxidase 1 안의 다양한 단백질들 사이의 물리적인 결합이 NADPH oxidase 1 complex의 효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 우리는 SH3YL1을 과발현 시킨 상태에서의 활성산소종의 생성을 측정해보았다. 그 결과 SH3YL1이 과발현 되어있을 때, 성장인자에 의해 유도되는 Nox1의 활성산소종 생성이 저해되는 것을 확인하였다. SH3YL1이 Nox1과 Noxo1/p47phox와 결합하는 것은 Nox1 복합체가 최고의 효소활성을 보이기 위해 Noxa1/p67phox가 Nox1 복합체에 결합하는 것과 유사하다. 그러나 활성산소종의 생성을 감소시키는 것을 확인하였으며 그렇다면 SH3YL1이 Nox1 복합체 형성을 방해하는 역할을 할 것이라고 생각하였고 이를 확인해 보았다. In vivo co-immunoprecipitation(Co-IP)을 통해 SH3YL1을 과발현 시켰을 때 Noxo1과 Noxa1의 결합이 약해지는 것을 확인하였으며 Nox1 복합체에 Rac이 결합하는 것 또한 방해 되어 지는 것을 알 수 있었다. 위의 결과들을 종합하여 볼 때 SH3YL1이 외부자극에 의한 NADPH oxidase 1 complex의 온전한 형성을 방해함으로써 활성산소종의 생성을 조절한다고 예상된다.