BMP2-Induced reactive oxygen species production is involved in neuronal differentiation and apoptosis of neural crest stem cells

Abstract

줄기세포(Stem cells)는 신체내의 각 기관에 존재하는 다양한 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 세포들을 지칭한다. 줄기세포에 관한 연구의 중요성은 유전병이나 혹은 후천적인 질환에 의해 손상된 조직과 세포들을 줄기세포를 이용하여 치료 혹은 대치 할 수 있다는 가능성에 있다. 그러나 줄기 세포를 의학적 목적으로 사용하기 위해서는 먼저 이들에 대한 분자 수준에서의 이해가 필요하다. 우리가 실험에 사용한 세포는 Stem cell의 한 종류로 신경능선줄기세포(neural crest stem cell)라고 불리우는 다분화능의 세포이다. (이하, NCSC라 명명한다.) NCSCs는 말초신경계를 만드는 줄기세포로서 순체 (clonal) 배양이 가능하기 때문에 growth factor나 전사조절인자의 역할을 조사하는데 용이하다는 장점을 갖고 있다. 또한 여러 가지 growth factor들을 주었을 때, 평활근세포(smooth muscle cell), 신경세포(neuron), 교세포(glial cell)의 다양한 분화가 잘 알려져 있다. 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가, 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되거나 펩티드 성장인자, cytokine들 및 다양한 작용의 자극에 의해 발생되는 것이 활성산소종이다. 활성산소종의 생성 기작은 포식세포의 세포막에 존재하는 NADPH oxidase 2 (Nox2, gp91phox)의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox 와 p22phox (cytochrome b558)와 세 개 이상의 세포질 단백질들 (p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어져있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화 효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도하여 활성산소종을 생성한다. 뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체 (Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)와 세포질 단백질의 유사체 (Noxo1; p47phox 유사체, Noxa1; p67phox 유사체)도 존재함이 보고되었다. 발현의 정도는 조직마다 다르며 Nox1의 경우 결장상피세포 (colon epithelial cell)에서 많이 발현되어있으며, Nox3는 신장, 간, 폐 등의 fetal tissue에서 발현되어있으며, Nox4는 신장조직과 신경세포등에 많이 발현되어있다. 특히 Nox4는 신경관련 세포와 내피세포에 발현되어있으며 Nox2는 내피세포와 외진피 세포에서 발견되고, Nox1은 평활근세포와 내피세포에서 발현된다고 알려져 있다. 또한 이 활성산소종은 생산이 과잉 되면 생체에 대해 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여, 유해산소라고 명명되기도 한다. 세포내의 거대한 분자 (단백질, 지질 등)를 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고, 세포를 사멸시키는 등의 작용으로 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발하며, 암, 근이형증, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 허혈성질환, 동맥경화증과 같은 다양한 퇴행성 질병의 원인과 일반적 노화와 관계가 있기 때문이다. 이렇게 노화나 세포 사멸을 유도하는 인자로 인식되어 왔던 활성산소가, 근래에 와서는 그 반대로, 세포 사멸을 억제할 수 있음도 확인되고 있는 것이다. 암세포에 있어서도 마찬가지로, 그 정상생리를 교란시켜 세포사멸를 유발 할 수도 있고, cell cycle arrest 효과를 나타내어 암세포수의 증식을 억제할 수도 있음에 따라, 활성 산소는 발암과 항암의 병리 과정에 공통으로 관여하는 양면성을 지니고 있음이 분명하다. 최근 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어서는 세포내 신호전달 반응에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger)임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응들을 유도하는 기능을 갖는다. 따라서 이러한 점을 고려해 볼 때 우리는 NCSC에서의 분화가 활성산소종과 연관이 있지 않을까 생각하게 되었고, 이를 확인하기 위해 NCSC에 growth factor인 BMP2를 주어 신경세포로의 분화를 유도할 때 활성산소종이 생성되는 것을 알 수 있었다. 또한 flavoproteins의 inhibitor인 diphenylene idonium (DPI)를 이용해 NADPH oxidase에 의한 oxidative burst를 막았을 때 신경세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하여 활성산소종의 근원이 NADPH oxidase였고, 그중 Nox4였음을 알았다. NADPH oxidase 4 (Nox4)는 활성산소종을 생성하는 효소로 잘알려져있으며, 신경능선줄기세포(NCSC)에서 우세하게 많이 발현된다. 그렇다면, 이번에는 활성산소종이 분화에 어떠한 연관이 있는지 알아보기 위해 Nox4 발현을 감소시켜보았다. 그 결과 신경세포로의 분화가 억제될뿐만아니라, 활성산소종의 생성도 감소하는 것을 확인하였다. 또한 극대화의 효과를 위해 Nox4발현을 거의 모두 감소시켰을 때는 세포사멸 현상을 보이기도 하였다. 이제까지의 결과들을 통해 활성산소종을 매개로 하는 신경능선줄기세포에서 Nox4 발현 역할의 중요성을 확인하였고, 이러한 활성산소종의 존재가 세포의 생장과 분화에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 어쩌면 활성산소종 level의 미세한 조정이 NOX활성의 positive feed-back mechanism에 의해 조절될수있을것이라 생각된다.;NCSCs are multipotent, self-renewing PNS neural progenitors that can differentiate to autonomic neurons, glia, and smooth muscle cells. The differentiation of NCSCs can be promoted by specific instructive extracellular signals. Of them, BMP2 signaling from the surface ectoderm immediately adjacent to the neural plate appears to be a key player in murine neural crest cell induction. Several lines of evidence suggest that reactive oxygen species functions of second messengers in cell differentiation. NADPH oxidase 4 (Nox4), ROS generating enzyme, was predominately expressed in NCSC and pretreatment DPI, significantly inhibited NCSC differentiation. These findings are interpreted in terms of a positive feed-back mechanism of NOX activation enabling a fine tuning of the ROS level to be possibly used in redox-mediated for growth and differentiation of NCSCs. In conclusion, we have demonstrated that Nox4 is an important component of the NADPH oxidase complex in neural crest stem cells. Nox4 knockdown by small interfering RNA failed to BMP-dependent differentiation, suggesting that expression of Nox4 plays a role in neuronal cell differentiation.