세포밖 NDP kinase (Nm23)와 sentrin의 생화학적 성질 및 기능에 관한 연구

Abstract

Nucleoside diphosphate (NDP) kinase는 nucleoside-5' -triphosphate (NTP)의 말단 인산기를 nucleoside-5' -diphosphate (NDP)로 이동시켜 주는 효소로 세포내에서 중요한 역할은 NTP를 공급해 주어 생체내에서 필요한 NTP pool을 유지시키는 것으로 생각되어져 왔다. 그러나 최근들어 NDP kinase가 nm23의 gene product인 Nm23과 동일하다는 것이 밝혀짐에 따라 관심이 크게 증가되고 있고 또한 cell proliferation, differentiation, development, metastasis, apoptosis 등의 다양한 생체기능이 있는 것으로 알려지고 있다. Human N에 kinase는 NDPK-A (Nm23-H1)와 NDPK-B (Nm23-H2)로 구성되어 있음이 밝혀졌는데, NDPK-A (Nm23-H1)는 암전이 억제 인자로 작용하고 NDPK-B (Nm23-H2)는 c-myc oncogene promoter에 nuclease-sensitive element에 결합하여 transcription을 활성화시키는 PuF와 동일하다는 것이 확인되었고, 최근에는 새로운 NDPK gene인 DR-nm23, nm23-H4, nm23-H5, nm23-H6등이 더 발견되어졌다. NDPK (Nm23)는 세포내 cytosol과 핵에 분포하는 것으로 알려져 있는데, 세포밖에서 mouse myeloid leukemia M1 세포의 분화 억제 인자로 작용함이 밝혀지면서 세포밖의 분포가 제기되어졌고, 세포밖으로 분비되어진 NDPK(Nm23)이 세포밖에서 구체적으로 어떤 작용을 하는지에 대해서는 아직 밝혀져 있지 않다. 본 실험에서는 크게 두가지 부분에서 Nm23에 대한 연구를 실시하였다. 첫째, 세포내에서 serum starvation, heat shock등과 같은 stress에 대한 Nm23의 영향을 알아보기 위하여 Nm23이 과발현된 유방암 세포 P57을 control인 K10과 비교하여 실험하였다. K10과 P57에 heat shock을 가한 후에 회복시키면서 각 시점에서의 단백질 합성 양상의 변화와 SAPK/JNK의 활성화에 대한 영향을 알아보았고, 또한 성장인자의 공급을 차단시킨 serum starvation 상태에서 K10, P57 세포내 단백질 합성 pattern의 변화를 2D SDS-PAGE로 비교하여 변화된 단백질들을 MALDI-TOF-MS를 이용하여 확인하였다. 둘째, serum starvation과 같은 stress에 의해 Nm23 단백질이 hsp70과 함께 세포밖에 존재함을 확인하였으며 이렇게 세포밖으로 분비되어져 나온 Nm23을 순수 분리 정제하여 세포내에 존재하는 Nm23 단백질과 구조 및 효소 활성 등의 생화학적 성질에서 어떤 차이점을 가지는지 비교하여 관찰하였고, 세포밖에 존재하는 Nm23 단백질이 세포의 성장과 motility에 미치는 영향 등을 관찰하여 세포밖에서는 Nm23 단백질이 가지는 기능을 규명하고자 하였다. Yeast two-hybrid상에서 Nm23과 결합하는 단백질로 알려진 sentrin은 101개 amino acid를 지닌 ubiquitin-like protein으로서, Fas/APO-1과 tumor necrosis factor receptor 1의 death domain과 작용하여 anti-Fas/APO-1 혹은 TNF가 야기하는 세포의 죽음으로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. Setrin은 ubiquitin과 18% 동일하고 48% 유사한 ubiquitin domain (residues 22-97)을 지니고 있어서 ubiquitination pathway와 유사한 방법으로 target protein에 conjugation하는 것으로 알려져 있는데 이 때 E1, E2, E3로 구성된 복합적인 효소 반응을 필요로 하고 그 중에서 특히 E2 enzyme인 Ubc9이 sentrinization pathway에서 중요한 conjugating enzyme으로 작용하고 있음이 밝혀졌다. Sentrin에 의해 modification되는 주요한 target substrate로 현재까지 밝혀진 것은 RanGAP1, IκBα, PML 등이 있는데, 더 많은 target molecule들을 밝혀내는데 관심이 집중되어지고 있다. 본 실험에서는, recombinant 단백질인 sentrin을 발현시켜 분리 정제한 후 sentrin polyclonal antibody를 제작하여 다양한 조직과 세포내에서 단백질 수준에서 sentrin의 발현과 분포 정도를 알아보았다. 또한, 본 실험실에서 확보하고 있는 인간 태반의 cytosol, membrane, nucleus 분획내에 존재하는 여러 요소들이 sentrin에 어떤 변화를 주는지 관찰하고 이에 대한 nm23 단백질의 영향을 알아보고자 하였다. 세포내에서 sentrin이 다른 target 단백질들에 conjugation하는데 중요한 E2 conjugating enzyme인 ubc9을 recombinant 단백질로 분리 정제하여 in vitro 상에서 sentrin과 ubc9의 interaction을 알아보고 wild-type cell lysate에 존재하는 다양한 다른 단백질들을 sentrinizaion시킬 때 ubc9의 직접적인 연관성을 살펴보고 이 때 nm23 단백질이 어떠한 영향을 미치는지 밝혀내고자 하였다. 앞으로는 sentrin과 ubc9의 transfection assay를 통하여 in vivo 상에서 ubc9에 의해 sentrinization되는 target 단백질들을 찾아내고 이러한 target 단백질의 성질과 기능에 sentrin이 어떠한 역할을 하는지에 대한 연구가 계속 진행될 예정이다. ;Nucleoside diphosphate (NDP) kinase catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the corresponding N에 and the primary role of N에 kinase in the cell was considered as the maintenance of a pool of nucleoside triphosphate required for the biosynthesis. Recently, the interest of N에 kinase was increased due to their identification as the product of nm23, a putative metastasis suppressor gene. Also, protein Nm23 has been recognized to have a multifunctional roles in cell proliferation, differentiation, development, metastasis and apoptosis etc. In humans, two NDPKs have been identified as NDPK-A (Nm23-H1) and NDPK-B (Nm23-H2). NDPK-A acts as a suppressor of the metastasis of come tumor types and NDPK-B was shown to be identical to PuF, a protein that binds to a nuclease-sensitive element in the promoter of c-myc oncogene and activates the transcription of the c-myc oncogene. In vitro, Human NDPK was also identified as a differentiation inhibitory factor of myeloid leukemia M1 cells. Very recently, new NDPK genes, DR-Nm23, nm23-H4, nm23-H5 and nm23-H6 have been identified. In this study, at first, control K10 and nm23-transfected cell line P57 were examined to investigate the effect of Nm23 for the stress such as serum starvation and heat shock. In K10 and P57 cells, immediate inhibition and recovery after a few hours of protein synthesis were shown by heat shock and SAPK/JNK activation was measured. Also, during serum starvation, the change of cellular protein synthesis patterns of K10, P57 were compared using 2D SDS-PAGE and the alteration of protein expression was identified by applying MALDI-TOF-MS. Secondly, extracellular Nm 23 and hsp70 were secreted by serum starvation and extracellular Nm23 purified from P57 conditioned media were characterized in terms of enzymatic activity and structural properties as compared with other various cytosolic Nm23. The biological function of extracellular Nm23 in cell proliferation, cell motility was investigated and further studies are performing to characterize physiological roles of extracellular Nm23. Sentrin, a protein binding to Nm23 in a yeast two-hybrid screen is a 101-amino acid ubiquitin-like protein that protects cells against both anti-Fas and tumor necrosis factor induced cell death. Sentrin contains an ubiquitin domain (residues 22-97) that is 18% identical and 48% similar to ubiquitin. Sentrin can be conjugated to other proteins in a manner analogous to protein ubiquitination. Ubc9 appears to be a key conjugating enzyme for the sentrinization pathway. Recent data on the modification of proteins by sentrin focuses on three major substrates, RanGAP1, PML, IκBα and other protein substrates for sentrin modifications are investigated. In this study, recombinant sentrin was overexpressed and purified. We produced sentrin polyclonal antibody and determine the distribution of sentrin in various tissues and the subcellualr localization in whole cell, membrance, nucleus fraction. Also, modificaion of sentrin in placenta cytosol, membrance, nucleus fractionand nm23-H1,-H2 effects were monitored. We purified recombinant Ubc9 a key conjugating enzyme for the sentrinization pathway. In vitro, we study the interaction between sentrin and ubc9, the direct requirement for ubc9 in sentrinization to other proteins in wild-type cell lysate and the effects of nm23. Next, we will have transfection assay with sentrin or ubc9 and investigate target proteins to be sentrinized, the modification function of target protein by sentrin.