Mechanisms of epithelial-mesenchymal transition in human peritoneal mesothelial cells

Abstract

고농도 포도당을 함유한 상용 복막 투석액을 사용하는 복막 투석 환자는 복막섬유화와 복막의 투과성 증가가 동반되어 투석을 중단하게 된다. 상피세포-중간엽세포 이행(epithelial-mesenchymal transition:EMT)은 상피세포 자체의 특성이 감소되고, 세포 외 기질(extracellular matrix:ECM) 생산이 증가된 myofibroblast의 특성을 나타내어 조직 섬유화의 발생에 관여하는 중요한 기전으로 제시되고 있다. 최근 연구에서 사람의 복막 중피세포(human peritoneal mesothelial cells:HPMC)에서 복막 투석으로 인해 EMT가 일어남이 보고되었다. 본 연구는 복막 EMT의 발생 기전을 규명하고자 하였다. HPMC는 개복수술 환자의 동의를 얻어 분리하였고, 10%의 우태아혈청(fetal bovin serum:FBS), 100 IU/mL penicillin과 100 ㎍/mL streptomycin을 포함한 M199 액체 배지에서 배양하였다. 혈청배제 상태에서 D형 포도당,H₂O₂, 또는 전환성장인자(transfer growth factor:TGF)-β1으로 96시간까지 처리했다. 고농도 포도당, H2O2과 TGF-β1은 HPMC의 EMT를 유도하였고, 고포도당에 의하여 유도된 EMT는 항산화제인 N-acetylcysteine (NAC)과 catalase 뿐 아니라 NADPH oxidase 억제제인 diphenyleneiodonium (DPI)과 apocynin에 의해 억제되었다. 고포도당에 의한 EMT는 MEK 억제제와 p38 MAPK 억제제에 의하여 효과적으로 억제되었다. 이 같은 결과는 활성산소족(reactive oxygen species:ROS)-MAPK 경로가 고농도 포도당에 의하여 유도되어 복막의 EMT 진행에 중요한 역할을 함을 시사하였다. 고포도당에 의한 EMT는 TGF-β1 억제에 의하여 효과적으로 억제되어, TGF-β1이 이를 매개함을 시사하였다. Illumina human-RefSeq-8을 통한 microarray와 K-means와 Heat map 분석법 결과 TGF-β1으로 자극한 HPMC에서 14개 유전자가 상향 조절되었고 9개 유전자가 하향 조절되었다. NOX4 (NADPH oxidase 4)의 증가는 EMT 기전에 ROS가 관여함을 뒷받침해 주는 증거이며, 항섬유화 작용을 지닌 adrenomedulline의 감소는 adrenomedullin과 EMT의 연관성에 대한 추후 연구의 필요성을 시사하였다. TGF-β1 자극에 의해 새롭게 합성된 단백질을 [35S] methionine을 이용하여 2-dimensional gel 전기영동으로 분리하고 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석하였을 때, 4개의 단백질은 계속 증가했고, 6개의 단백질은 48시간 후 증가하나 96시간 후 다시 감소하였으며, 7개의 단백질은 감소 후 증가, 6개의 단백질은 계속 감소하는 경향을 나타내었으며, 세포 구조, chaperone, 신호전달, 산화적 스트레스 등에 관여하는 단백질이었다. 본 연구는 포도당을 함유한 상용 투석액을 장기간의 복막 투석에 사용 했을 때, 고농도 포도당에 의해 유도된 ROS가 복막 섬유화로 진행되는 EMT에 중요한 역할을 함을 시사하였다. 이에 더하여, 복막의 EMT와 관련된 기전을 더 이해하기 위해서는 microarray와 proteomic analysis에서 발현된 gene과 단백질의 기능에 대한 추후 연구가 필요하다.;Long-term peritoneal dialysis (PD) using conventional glucose-based PD solution is associated with progressive increase in the thickness of peritoneal membrane, predominantly in the submesothelial compact collagenous zone, and membrane hyperpermeability. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) of epithelial cells, characterized by loss of epithelial cell characteristics and gain of extracellular matrix (ECM)-producing myofibroblast characteristics, is an important mechanism involved in tissue fibrosis. Recent data suggest that human peritoneal mesothelial cells (HPMC) undergo EMT during PD and that EMT may play an important role in the development and progression of peritoneal fibrosis leading to failure of peritoneal membrane function. The purpose of the present study was to understand the mechanisms involved in EMT during PD. HPMC obtained from consenting patients undergoing elective abdominal surgery were cultured in M199 containing 10% fetal bovine serum and antibiotics. Synchronized HPMC were stimulated by different concentrations of D-glucose, H₂O₂, and TGF-β1 up to 96 h in the presence and absence of antioxidants. High glucose and H₂O₂ as well as TGF-β1 induced EMT in HPMC and high glucose-induced EMT was blocked by antioxidants such as N-acetylcystein, catalase, diphenyleneiodonium, and apocynin. High glucose-induced EMT was effectively inhibited by MEK inhibitor and p38 MAPK inhibitor. These data suggested that reactive oxygen species (ROS)-MAPK pathway activated by high glucose may play an important role in the development of EMT. High glucose-induced EMT was also inhibited by anti-TGF-β1 antibody and TGF-β1 receptor blockers, suggesting TGF-β1 mediated high glucose-induced EMT. Microarray utilizing Illumina human-RefSeq-8 followed by both K-means clustering and Heat map analysis showed that 14 genes were significantly upregulated and 9 genes downregulated in HPMC cultured under TGF-β1. Upregulation of NOX₄, a catalytic subunit of NADPH oxidase, supported the importance of ROS as a pathogenic mechanism of EMT. On the other hand, adrenomedullin, an antifibrotic mediator, expression was most significantly decreased. The functional significance of decreased adrenomedullin expression needs to be further investigated. Cellular protein were extracted, separated by 2-dimensional gel electrophoresis, and identified by using matrix-assisted laser desorption and ionization-time of flight mass spectrometry. Newly synthesized protein profile was obtained using [35S] methionine. Four proteins were continuously upregulated, 6 proteins upregulated at 48 h followed by downregulation at 96 h, 7 proteins downregulated followed by upregulation, and 6 proteins continuously downregulated. These proteins have function in structure, chaperone, signaling, and oxidative stress. The present data suggest that ROS induced by high glucose may play an important role in the development of EMT leading to peritoneal fibrosis in long-term PD using conventional glucose-based PD solution. Further functional study utilizing microarray and proteomic analysis data will provide us better understanding of the mechanisms involved in peritoneal EMT.