SNP in FRG1 gene is correlated with the expression of alternative splicing variant which is subject to NMD pathway

Abstract

Bioinformatics는 molecular biology, genetic, 또는 clinical data의 연구에 있어서 informatics tool과 techniques으로 이용된다. 이러한 bioinformatics를 이용하여 FRG1 gene에서 single nucleotide polymorphisms (SNPs)과 alternative splicing variant가 서로 연관되어 있음을 발견하였고, 그 결과를 실험으로 증명하였다. SNP란, genome 상의 single nucleotide에서 일어나는 DNA sequence variation이며, SNP의 상당수는 splicing과 관련되어 있다고 알려져 있다. Sequence analysis를 통해 bioinformatics의 결과를 확인한 결과, SNP type에 specific하게, G allele을 가지는 경우에는 exon skipping이 일어나고, A allele을 가지는 경우에는 exon retention이 일어남을 입증하였다. 이 때, exon이 retention 일어나는 mRNA의 경우, retention이 일어나는 exon 7 에 premature termination codons (PTCs)이 존재하게 되어 nonsense mediated mRNA decay (NMD) pathway에 의해 mRNA가 degradation된다. NMD pathway란, PTCs를 가지는 mRNA를 선택적으로 제거하는 기전으로, splicing을 거친 mRNA의 마지막 exon-exon junction으로부터 50-55nt upstream에 PTC가 존재하는 경우 NMD의 target이 되어 mRNA가 제거된다. 이를 증명하기 위해, NMD pathway의 core component인 Upf1을 RNA interference 기법과 dominant negative의 activation을 이용하여 down-regulation하여 NMD를 저해한 결과, 이 mRNA가 NMD의 target임을 확인하였다. 또한 FRG1에 존재하는 이 SNP가 alternative splicing을 일으키는 직접적인 원인인지 알아보기 위해, minigene assay를 수행하였다. 이 연구의 결과, FRG1 gene에 존재하는 SNP가 alternative splicing을 일으키는 직접적인 원인은 아니지만, 이 SNP type과 splicing pattern과는 밀접한 상호관련성을 지니고 있음을 밝혀내었다. SNP type에 따라 특이적으로 exon skipping과 retention이 일어나는 것으로 보아, 이 SNP가 다른 intronic SNP와의 interaction에 의해 alternative splicing을 조절할 수 있다고 예상된다. 따라서 앞으로 이 SNP와 관련된 alternative splicing에 중요하게 작용하는 intronic SNP를 찾아내어, FRG1 gene에서 SNP와 alternative splicing variant 사이의 직접적인 연관성을 입증하고자 한다.;Bioinformatics is the use of informatics tools and techniques in the study of molecular biology, genetic, or clinical data. We identified correlation between single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alternative splicing variant utilizing bioinformatics, and these results confirmed experimental approaches. In this study, two types of splicing pattern correlated with SNP in FRG1 gene. Splice type 1 has ‘G’ at SNP site, and the formation of splice variant 1 during the skipping of exon 7. On the other hand, splice type 2 has ‘A’, and the formation of splice variant 2 during the retention of exon 7. We identified exon skipping or retention events correlated with SNP that exon retained transcript containing premature termination codons (PTCs) and degraded by NMD pathway. To confirm this, we impaired NMD in HT1080 cells by down-regulating hUpf1 through RNAi and dominant negative. This SNP was further investigated using a minigene splicing system. As a result, this SNP was not the direct cause of alternative splicing, but highly correlated with alternative splicing in FRG1.