Saccharomyces cerevisiae의 chitin synthase 3의 활성조절 기작 규명과 Chitosan의 항진균성 조사

Abstract

Saccharomyces cerevisiae에서 chitin을 합성하는 동위효소 중 하나인 chitin synthase 3(Chs3p)는 세포벽의 chitin 합성과 bud 형성 초기단계에 나타나는 chitin ring을 만드는데 관여하며, CHS3 유전자에 의해 발현된다. CHS3 유전자가 disruption된 것을 확인한 HPY3 strain에 Chs3p와 Chs4p의 두 효소가 interaction하여 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 MIRC3-4 지역이 mutation된 Chs3p를 발현시키는 strain을 만들어 그 조절 기작을 조사하였다. 이 mutant들은 growth rate이 wild type보다 약간 감소하며, chitin synthase mutant의 특징으로 서로 뭉쳐 자라는 morphology를 보이기는 하였으나, 세포주기를 따라 비교적 정상적인 형태를 나타내는 것을 actin staining과 DAPI staining을 통해서 확인하였다. Functional assay에서 Chs3p enzyme activity가 전반적으로 감소하고 chitin content도 감소하였으나, 둘 사이에서 상관관계를 설명하기 힘들었다. 이는 Chs7p와 같은 Chs3p의 또 다른 조절인자들과의 작용이 관련되어 있을 것으로 추정되는 결과이다. 한편, mutant cell의 Calcofluor white staining에서 cellular chitin은 존재하지만 chitin ring이 나타나지 않는 특이한 현상을 발견하게 되었다. 따라서, Chs3p가 G1시기에 chitin ring을 합성할 때와 cytokinesis 시기에 cellular chitin을 합성 할때에 서로 다른 complex를 형성하여 작용할 것이라는 가정을 하였고, 이에 따른 Chs4의 기능을 알아보기 위하여 mouse anti-Chs3p polyserum을 사용하여 indirect immunofluorescence를 수행하였다 그 결과, 세포주기 전반에 걸쳐서 Chs3p는 bud neck부위에 정상적으로 위치하는 것으로 관찰되었고, Chs4p와 Chs3p의 interaction에 의한 조절에서는 Chs3p를 그 작용 부위에 정확하게 위치하게 하는 역할과 직접적인 activator 역할이라는 Chs4p의 두 가지 기능 중에서 activator로서의 역할이 주요할 것으로 생각하게 되었다. 한편, 병원성 곰팡이인 candida속의 C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, C. parapcilosis에 대한 chitosan의 항진균 활성을 조사하였다. 분자량이 수십~수백만에 이르는 천연 polymer인 chitosan은 여러 가지 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다. 분자량 42,000인 저분자량의 chitosan을 처리했을 때에, Candida albicans의 병원성 형태인 균사체형을 비롯하여 다른 Candida속의 효모형에서 cell이 깨지거나 서로 엉겨 붙었다. 균사체형은 0.1%농도 이상에서, 그리고 효모형은 0.05% 농도 이상에서 확실한 항진균 활성을 보였다. 그러나 분자량 1,000 이하인 chitosan oligomer를 처리한 것은 그 활성이 현저히 감소하여 0.3%농도 이상에서 활성을 보이기 시작하였다. 따라서, 저분자량 chitosan의 항진균성을 확인할 수 있었고 그에 비하여 chitosan oligomer의 항진균활성은 뚜렷하게 낮은 결과를 보였다. 이 결과는 in vitro에서 균의 생장이 가장 왕성한 상태의 약 10^(9)~10^(12) cell/㎖에서 작용하는 chitosan의 농도이므로, 숙주 내에 존재하는 균의 상태와 그 수에 따라서 항진균 효과를 나타내는 chitosan의 농도가 달라질 것으로 생각된다. 이와 같이, 본 실험은 효모 chitin synthase의 조절기작과 그 특성을 밝혀 균의 세포벽만을 선택적으로 공격할 수 있는 항진균제의 개발과, 인체에는 해가 없고 항진균성을 가진 물질로 chitosan을 연구, 발전시키는 토대가 될 것으로 기대된다.