Oxidative stress에 의한 GAPDH의 생화학적 변화에 관한 연구

Abstract

최근 들어 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS)과 free radical은 다양한 생리학적, 병리학적 현상에서 하나의 mediator로 중요성이 대두되고 있다. 세포에 외부로부터 ROS를 처리한 경우 다양한 세포내 신호 전달 기전을 유발하기도 하며, 어떤 경우에는 apoptosis를 통해 결국 세포를 사별하게도 한다. Oxidant에 의해 유도되는 이러한 stress에 대해 내열성 (thermotolerance)이 저항성을 유도한다는 보고가 최근에 있었다. 하지만 내열성이 어떻게 oxidant에 대해 저항성을 가지는지는 잘 알려져 있지 않다. 그리고 diamide와 H_(2)O_(2)의 세포내 신호 전달 기전이 같지않다는 보고가 있다. Diamide는 세포내 단백질을 crosslinking 시킴으로서 변성시키는 sulfhydryl oxidant이고 H_(2)O_(2)는 다양한 영역에 작용하는 nonspecific oxidant이다. 이러한 이유로 본 연구에서는 heat shock protein이 많이 발현되어 내열성을 가진 세포에서 diamide와 H_(2)O_(2)에 대한 반응을 연구하였다. 본 연구에서 사용한 세포로는 mouse의 radiation-induced fibrosarcoma인 RIF-1과 이를 45℃의 열로 stress 를 주고 37℃에서 회복시키기를 여러 번 반복하여 내열성을 갖게 만든 즉, heat shock protein이 많이 발현되어 있는 TR-RIF-1에서의 diamide와 H_(2)O_(2)에 대한 반응을 비교하는 실험을 수행하였다. 두 세포에 다양한 농도의 diamide를 처리하고 단백질 합성률을 보면 TR-RIF-1이 RIF-1보다 dimide에 대해 저항성이 큰 것으로 나타났다. 하지만 H_(2)O_(2)를 처리한 경우에는 두 세포간의 차이가 거의 없었다. 이러한 diamide와 H_(2)O_(2)에 대한 반응이 다른 원인을 알아보기 위해서 chaperone의 일종인 HSP27과 HSP70에 대해 살펴보았다. 그 결과 두 oxidants에 의해 모두 세포내 ROS는 생성되지만 diamide는 HSP27과 HSP7O를 발현시키는데 반해 H_(2)O_(2)는 HSP27과 HSP70를 거의 발현시키지 않았다. 그리고 H_(2)O_(2)와 diamide에 의한 단백질 합성 pattern 변화를 2D gel electrophoresis와 MALDI-TOF-MS로 알아본 결과 vimentin과 hsp65의 합성이 증가하는 것으로 나타났으나 두 산화제 간의 차이는 없었다. 또한 oxidative stress와 heat shock의 signal transduction 차이를 SAPK assay 와 NFκB assay로 밝혀내고자 하였다. SAPK는 두 stress에 의해 모두 활성화되는데 그 활성이 세포내 redox potential 변화와 관계되는지를 확인하기 위하여 항산화제인 NAC (N-acetyl-L-cysteine)을 전처리해 SAPK 활성을 측정함으로서 ROS가 SAPK 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. NAC 전처리에 의해 oxidative stress는 SAPK를 활성화시키지 못하지만 heat shock의 경우는 그 활성이 그대로 유지되었다. 이로서 heat shock signal은 ROS와는 무관한 pathway로 SAPK를 활성화시키며 heat shock은 세포내 redox potential 변화에 영향을 주지 않는 것으로 생각된다. 그리고 NFκB는 transcription factor로 다양한 자극에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있는데 그 활성을 ROS가 매개한다는 보고가 있다. 세포에 oxidative stress와 heat shock을 준 후, NFκB가 활성화되는지 여부를 확인하고 heat shock signal 전달에 ROS가 관여되는지를 알아보고자 하였다. 그 결과 heat shock의 경우는 NFκB를 활성화시키지 않았다. 이러한 두 결과로 heat shock signal의 전달에 ROS가 관계되지 않는 것으로 생각할 수 있었다. 또한 oxidative stress의 molecular target을 연구하는 데 있어 산화된 단백질을 alkylating 물질인 iodoacetic acid로 radiolabeling시키는 방법을 사용하여 찾아내고자 하였다. 즉 oxidants에 의해 세포내에서 산화된 단백질은 pH 6.5에서 [^(14)C]-iodoacetic acid로 labeling이 되지 않기 때문에 이 성질을 이용하여 확인하였다. 그 결과 glycolysis 효소인 GAPDH의 활성화 부위에 있는 Cys이 현저히 산화되는 것을 알 수 있었고 그것은 GAPDH의 activity와도 관련이 있는 것으로 확인되었다. 세포내의 GAPDH와 purify된 GAPDH에 H_(2)O_(2)나 diamide를 노출시키면 그 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었고, 이때 GAPDH의 pI값 변화가 일어나는 것도 확인할 수 있었다. 또한 H_(2)O_(2)에 의해 GAPDH의 localization이 변하는 것을 확인하였으며 GAPDH가 RNA splicing factor인 p54NRB PTB splicing factor와 interaction하는 것도 알 수 있었다. 그리고 GAPDH가 oxidative stress에 의한 세포독성에 보호 작용이 있는지를 알아보기 위해 GAPDH를 과발현시킨 세포와 control 세포에 H_(2)O_(2)를 처리하고 그 생존률을 조사해 본 결과 GAPDH가 세포 보호 작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이로서 GAPDH는 oxidative stress에 의해 민감하게 반응함과 동시에 그 stress에 대한 보호 작용을 가진다는 것을 알게 되었다.;Reactive oxygen species (ROS) and free radicals are proposed as mediators in various physiological and pathological processes. Exposure of cells to extracellular ROS initiates a variety of intracellular signaling pathways, which may lead to cell death through apoptosis. Recently, Thermotolerance has been shown to protect oxidant-mediated apoptosis. But it is poorly understood how Thermotolerance protect all oxidant- mediated apoptosis. And it has been reported that there is only partial overlap in intracellular signaling pathway induce apoptosis by diamide and H_(2)O_(2). Diamide is a sulfhydryl oxidant, which can denature the proteins by cross-linking, and (H_(2)O_(2) is a nonspecific oxidant. In this study, thermotolerant cells having overexpressed hsps have been adopted to examine the possibility different signaling pathways In response to diamide and (H_(2)O_(2). Radiation-induced mouse fibrosarcoma cell line (RIf-1) and its thermotolerant cell line (TR-RIF-1), having elevated levels of heat shock proteins (hsps), were used to investigate the stress response to H_(2)O_(2) and diamide. When both cell lines were exposed to various concentrations of diamide and H_(2)O_(2), TR-RIF-1 was more significantly resistant to diamide than RIF-1, but not to H_(2)O_(2). Diamide treatment significantly induced hsp27 and hsp70, but H_(2)O_(2) treatment did not. The changes of protein synthesis patterns in response to oxidative stress, were identified by using 2D SDS-PAGE and MALDI-TOF-MS. It turned out that vimentin and hsp65 were overexpressed in cells treated with H_(2)O_(2) or diamide. And to elucidate the difference of slginal transduction in response to oxidative stress and heat shock, the activity of SAPK and NF_(κ) B were monitored. To ensure that the activation of SAPK by various stresses was related to a change in the cellular redox potential, the effect of the antioxidant NAC (N-acetyl- L-cysteine) on SAPK activation was studied. The result indicated that the activation of SAPK induced by diamide and (H_(2)O_(2) were mediated by alteration In the cellularredox state but the activation of SAPK induced by heat was not mediated by alteration in the cellular redox state. And we examined the activation of NF _(κ) B after oxidative stress or heat shock to identify whether heat shocksignaling is involved in ROS. The result showed that oxidant induced the activation of NF_(κ) B, but heat shock didn't. These results suggest that signal transduction of heat shock is not related to ROS and heat shock is different from oxidative stress. In this study, to investigate the target of oxidative stresses, intracellular sulfhydryl modification was examined. The oxidized proteins in cells exposed to oxidants were identified by labeling the active site Cys with[^(14)C]iodoacetate at pH 6.5. The results show that Cys in active site of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is a target of oxidants and the oxidation of GAPDH sulfhydryls after oxidant treatment is related to the loss of enzyme activity of GAPDH. And in this study, we monitored biochemical changes of GAPDH after oxidative stress. It was identified that oxidative stress induced the reduction of GAPDH activity and pI shift of GAPDH. And we examined whether the intracellular localization of GAPDH was changed by oxidative stress. The result showed that nuclear localization of GAPDH was reduced by oxidant. In addition, we found that overexpression of GAPDH in HEK293T cells protected them from cell death occurring in response to oxidative stress. This findings suggest that GAPDH is very sensitive to oxidative stress and may play a role in process that can protect cells from oxidative stress induced cell death.