Stress에 의한 vimentin의 생화학적 변화와 Aspergillus NDP Kinase에 관한 연구

Abstract

세포가 외부로부터 여러 가지 stress를 받으면 세포 내부에서 apoptosis가 일어난다. Apoptosis를 일으키는 세포에서는 핵 내 chromatin condensation, 세포 수축, membrane blebbing, DNA fragmentation 등의 현상을 관찰할 수 있다. Heat shock도 세포의 apoptosis를 유발한다. 본 연구실에서는 이전에 heat shock에 의해 유발되는 세포사멸 signaling에서 Racl small GTPase가 관여한다는 사실을 밝힌바 있다. 특히 2-dimensional gel electrophoresis, ingel digestion, MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)로 확인한 결과 vimentin이 Rat2세포에서 Rat2-RacN17세포보다 특정 시점에 그 합성이 더 많이 되는 현상을 보였다. 본 연구에서는 이를 바탕으로 vimentin과 Racl이 stress induced signaling에서 어떤 역할을 하는지 살펴보았다. Vimentin은 pl 값이 5.06, 분자량이 53.7 kDa이며 466개의 아미노산으로 구성되어 있는 intermediate filament이다. 현재는 그 자체가 세포의 외부적, 내부적 영향에 의해 역동적인 구조 변화를 일으킨다는 사실이 밝혀짐으로서 관심의 대상이 되고 있다. Vimentin은 세포가 분열할 때 또는 외부에서 약물이나 heat shock과 같은 stress를 받을 때 그리고 각종 kinase에 의해 인산화될 때 그 구조적 변화를 관찰할 수 있다. Stress를 받은 세포나 hypoxic/ischemic damage를 받은 뇌 조직, NaF로 손상된 조직 세포 등에서 hsp70과 vimentin이 서로 관련 있을 것으로 보고 연구되는 등 heat shock protein과의 연관성이 집중적으로 연구되고 있다. 이와 더불어 Rho kinase, NDPK-A, B, fimbrin, kinesin과 같은 단백질과 vimentin 사이의 연관성도 연구되고 있는 추세이다. 본 연구에서는 각종 stress를 받은 세포에서 vimentin이 어떻게 변화하는지 여부를 관찰하였다. Heat shock이나 sodium arsenite, H_(2)O_(2), damide 등의 stress를 처리한 세포에서 vimentin이 어떻게 이동하는지를 confocal microscope으로 살펴보고 heat shock의 경우 fractionation해서 확인하기도 하였다. Rat2와 Rat2-RacN17 세포에 각각의 실험을 시행하여 그 차이를 비교해 보면서 stress에 의한 vimentin translocation 과정에 Racl이 어떠한 작용을 할 것인지 확인해 보고자하였다. Western blot analysis와 2D-PAGE를 이용해 Rat2, Rat2-RacN17 두 세포 내에 존재하는 vimentin이 여려가지 형태로 존재함을 밝혔으며 heat shock에 의해 인산화 상태가 변함을 확인하였다. 그리고 confocal microscope으로 vimentin이 재배치되는 현상을 관찰하였으며 2D-PAGE, MALDI-TOF MS를 이용해 세포 내 vimentin과 결합하는 단백질로 myosin, tropomyosin등이 있음을 확인하였다. Vimentin과 결합하는 단백질 중에 nucleoside diphosphate (NDP) kinase는 중간단계에 high energy 인산화가 된 효소 중간체를 형성하며 nucleoside-5'-triphosphate의 말단 인산기를 nucleoside-5'-diphosphate (NDP)로 이동시켜 주는 효소이다. 이렇게 생성된 NTP로 각종 생합성에 필요한 CTP, UTP, GTP pool을 유지시켜주는 것이 NDP kinase의 주 역할이라고 생각되었다. NDP kinase의 기능 및 세포 내 역할에 대한 연구는 대체로 metastatic suppressor로써의 기능과 cell proliferation과 differentiation, development 조절 기능 두 가지 기능에 관하여 주로 연구되고 있다. NDP kinase는 진화과정에서 매우 conserve된 단백질로서 procaryote으로부터 eukaryote에 이르기까지 다양한 종에서 발견되어 연구되고 있다. 여러 가지 종에 서 발견되는 NDPK의 유사성을 살펴보면 초파리의 NDPK에 해당하는 awd 단백질은 M. xanthus NDPK와 50%의 동일성을, D. discoideum NDPK와는 60%의 동일성을 보이는 등 대체로 50-88%의 유사성을 보인다. Aspergillus nidulans에서 새로이 cloning된 NDPK의 생화학적 성질을 밝혔다. Aspergillus nidulans 발견되는 NDPK는 154개 아미노산으로 구성되어 있으며 인간 NDPK와 65%의 sequence similarity를 가진다. 그리고 현재까지 다른 isotype들이 존재하지 않는 것으로 보인다. 본 연구에서는 ATP-agarose affinity column chromatography를 이용해 Aspergillus nidulans의 NDPK와 recombinant Aspergillus NDPK를 순수 분리하였다. Aspergillus NDPK는 154개 아미노산으로 구성되어 인간 NDPK와 크기가 거의 유사하나 SDS-PAGE 상에서 다른 위치에서 발견되었다. 그리고 native한 상태에서 tetramer로 존재하는 것을 FPLC를 이용하여 밝혔다. Aspergillus NDPK가 인간 NDPK와 비교했을 때 훨씬 높은 반응성과 안정성을 지니고 있음을 단위 시간, 단위 효소량에 대한 활성도를 측정해 보고 온도나 urea에 대한 안정성을 연구 해 봄으로 알 수 있었다.;Vimentin (53.7 kDa, 466 amino acids) is a cytoplasmic intermediate filaments (IFs). Three separate domains can be Identified in vimentin : non-helical amino-terminal "head", carboxy terminal "tail" domain and central α-helical "rod" domain. Vimentin belongs to class Ⅲ of intermediate filaments together with desmin, glial fibrillary acidic protein and peripherin. Vimentin is highly dynamic structures in living cells in response to a variety of stimuli and during the cell cycle. Vimentin is an excellent In vitro target of a number of kinases, notably protein kinase A (PKA), protein kinase (PKC) and cdc2. The dynamic of IF appear to be exerted via interactions with heat shock proteins and with many kinds of Proteins such as Rho kinase, NDPK-A, B, fimbrin and kinesin. In this study, we examined the effect of various stresses on vimentin organization. We observed the remarkable reorganization of vimentin after heat shock, sodium arsenite, H_(2)O_(2) and diamide treatment by using confocal microscope. Racl appear to be involved in regulation of vimentin distribution. By using western blot analysis and 2D-PAGE, we investigated the composition of vimentin and vimentin binding proteins. Nucleoside diphosphate (NDP) kinase catalyzes the transfer of the terminal phosphate group of the nucleoside triphosphate (NTP) to the corresponding NDP. The primary role of NDP kinase was considered as the maintenance of a pool of NTP required for several biosynthesis. It has been studied as a metastatic suppressor and regulator of cell proliferation, differentiation and development. NDP kinase is highly conserved protein which is found in various species, from procaryote to eukaryote. Theses NDPKS of different species show 50-88 % sequence identity with each other Six isoforms of NDPK have been identified in human thus far. The NDPK in Aspergillus nidulans shares 65 % identity with human NDPK and there is no isotype. In this report we describe the ATP-agarose affinity column chromatography for purification of recombinant and endogenous Aspergillus NDPK. By using gel filtration column chromatography, we examined the native structure of Aspergillus NDPK. We also investigated the biochemical characteristics of Aspergillus NDPK.