HRF의 인산화 정도와 histamine 분비의 상관관계에 대한 연구

Abstract

최근 IgE-dependent histamine-releasing factor (HRF)가 growth-related tumor protein인 P2l, P23, 또는 TCTP (translationally controlled tumor protein)와 동일한 protein임이 밝혀졌으며, 본 실험실에서 yeast two-hybrid assay를 통해 HRF가 (Na,K)ATPase에 결합함을 발견하였다. 이로써 본 실험에서는 HRF가 (Na,K)ATPase와 상호 작용하여 histamine 분비에 관여하는지의 여부를 밝히고자 하였다. HRF의 98-100번째 amino acid에는 SIK라는 PKC 인산화 잔기가 위치하고 있는데, 실제로 HRF가 PKC에 의해 인산화됨을 확인하고 PKC가 인식하는 부위인 ser-98을 ala, asp로 치환하였다. 그 중 S98A HRF mutant는 wild type과는 달리 PKC에 의해 인산화 되지 않음을 알 수 있었다. 한편 HRF의 탈인산화형이 (Na,K)ATPase와 결합할 수 있으리라는 가능성 아래 HRF를 탈인산화 시키는 phosphatase를 동정해 보았다. RBL-2H3 cell을 이용하여 immuno-precipitation, affinity chromatography를 시행한 결과 protein phosphatase (PP) 1이나 2A가 아닌 PP2B (calcineurin)가 HRF와 상호작용함을 확인하였고, 이 때 PP2B의 catalytic subunit (60 kDa)과 regulatory subunit (19kDa) 모두를 확인하였다. 또한 RBL-2H3 cell에 PKC activator인 PMA, PKC inhibitor인 bisindolylmaleimide I 과 rottlerin, calcineurin inhibitor 인 cyclosporin A, PP1, 2A inhibitor인 okadaic acid, 그리고 ionomycin을 처리한 후 confocal microscopy를 이용해 인산화 정도에 따른 endogenous HRF의 localization을 관찰해 보고, 탈인산화된 HRF가 (Na,K)ATPase와 상호작용 하여 histamine분비를 촉진할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 마지막으로 N-terminal enhanced fluorescent protein vector pEYFP-N1과 pEGFP-N1에 각각 S98A HRF, S98B HRF를 subcloning하였다. 이렇게 완성된 constructs를 가지고, confocal microscopy를 시행함으로써 RBL-2H3 cell내 각각의 HRF위치를 확인할 수 있고, HRF 인산화 조절이 histamine분비에 미치는 영향과 이 때 관여하는 메카니즘을 고찰할 수 있게 되었다.;IgE-dependent HRF (also known as P23, its murine homolog P2l, or translationally controlled tumor protein) was initially described as a secretagogue for secretion of histamine from IgE^(+) basophils from a subset of allergic donors. However, HRF exerts its activity independently of IgE and it is likely that HRF bind to a cell-surface structure other than IgE. Recently HRF was isolated as a protein that interacts with 3rd cytoplasmic domain of the α subunit of(Na,K)ATPase using the yeast two-hybrid system. It was demonstrated that HRF acts as a cytoplasmic repressor of(Na,K)ATPase in our lab. Therefore, I searched for the signalling molecules that influence the interaction of HRF and (Na,K) ATPase. HRF is a Ca^(2+)-binding protein with 4 potential phosphorylation sties, one of which is a potential protein kinase C binding site. I introduced mutations (S98A, S98D) in ser-98 residue of HRF to identify the precise PKC phosphorylation site. In vitro kinase assay, only wild type HRF was phosphorylated by PKC, and S98A HRF was not affected by PKC. I also attempted to characterize the phosphatase which specifically dephosphorylates HRF by Immunoprecipitation and pull-down assay. In RBL-2H3 cells, HRF Interacted only with calcineurin(also called as PP2B, calcium/calmodulin-dependent phospha-tase) but not with PPI or PP2A. Using multi-photon imaging confocal system, I observed the localization of endogenous HRF after treatments of various pharmacologic modulators affecting signal transduction events. The results sugget that dephosphorylated HRF most likely binds to (Na,K)ATPase to regulate the histamine release.